2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、生肌因子5(Myf5)為生肌決定因子(MyoD)基因家族。MyoD基因家族包括生肌決定因子(MyoD)、肌細胞生成素(Myogenin)、生肌因子5(Myf5)和生肌調節(jié)因子4(Mrf4),它們具有單獨或協(xié)同調節(jié)肌細胞的增殖和分化、肌纖維大小和數(shù)量等功能。為了建立利用小鼠Myf5基因誘導綿羊骨髓間充質干細胞為成肌細胞的方法,本研究在克隆小鼠Myf5基因的cDNA基礎上,依次通過克隆載體pMD18-T Simple和表達載體pcDNA3.

2、1(+)相連,構建真核表達載體pcDNA3.1-Myf5;采用脂質體法將pcDNA3.1-Myf5轉染綿羊骨髓間充質干細胞,以觀察轉染細胞分化形成成肌細胞的能力。其研究結果如下:
  1.Myf5基因真核表達載體的構建
  參照GenBank(AK044894)中序列,通過PCR擴增提取小鼠肌肉組織中的總RNA,擴增獲得Myf5基因,與克隆載體pMD18-T Simple相連,通過雙酶切和測序鑒定后,與表達載體pcDNA3.

3、1(+)表達載體連接。經雙酶切鑒定和測序結果顯示,與理論序列相符,表明成功獲得Myf5基因的真核表達載體pcDNA3.1-Myf5;
  2.骨髓間充質干細胞轉染和分化
  將冷凍保存的綿羊骨髓間充質干細胞,經復蘇后進行傳代培養(yǎng),其結果,培養(yǎng)細胞呈現(xiàn)正常的形態(tài)和生長曲線;當傳代培養(yǎng)后細胞約達到80%匯合時,分別進行下列處理。A組:轉染pcDNA3.1-Myf5無內毒素質粒,并加入含有0.5%DMSO的F12培養(yǎng)基;B組:轉染

4、pcDNA3.1-Myf5無內毒素質粒,加入F12培養(yǎng)基;C組:含0.5%DMSO的F12培養(yǎng)基。當轉染后第12d開始,在倒置顯微鏡下,3組轉染細胞均呈現(xiàn)成肌細胞樣的細管狀形態(tài)。
  3.轉染細胞生物學檢測
  (1)免疫熒光檢測在轉染細胞傳代培養(yǎng)后的第17d,將上述3種細胞和作為對照未經轉染的骨髓間充質干細胞,用兔MyoD、MyoG、DES抗體處理進行免疫熒光檢測。其結果,與對照組不發(fā)生綠色熒光相比,三組轉染細胞均出現(xiàn)綠色

5、熒光;
  (2)流式細胞篩選在轉染細胞傳代培養(yǎng)后的第21d,利用BD Accuri-C6個人型流式細胞儀對3組轉染細胞進行流式細胞篩選檢測,其結果,三組細胞中三種基因表達(Desmin、MyoD、MyoG)都在96.4%以上(A組,98.6%、99.9%、96.9%;B組,99.9%、98.0%、99.1%;C組,97.4%、96.4%、99.9%)
  (3) Real-Time PCR檢測在轉染細胞傳代培養(yǎng)后的第28d

6、,對上述三種細胞和作為對照的骨髓間充質干細胞采用實時定量PCR檢測(選取三對引物分別為MyoG,Myf5和Desmin,一組內參引物GAPDH)。其結果,與轉染前細胞(標準化為1)相比,上述三種處理組的Myf5、MyoG和Desmi的相對表達量與均升高(A組分別為5.126±0.01倍、4.315±0.01倍和3.099±0.01倍;B組分別為4.484±0.01倍、3.124±0.01倍和2.889±0.01倍;C組分別為3.321±

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