利用MyoD基因誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的研究.pdf

1、已有研究證實(shí)，綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和成肌細(xì)胞等分化的潛能。為了建立誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的方法，本研究在構(gòu)建小鼠MyoD-pcDNA3.1真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染至綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、蛋白表達(dá)以及基因表達(dá)等檢測(cè)，以期最終獲得綿羊成肌細(xì)胞。本研究中獲得結(jié)果如下：
　　1.小鼠MyoD基因的克隆參照GenBank中的小鼠

2、MyoD基因序列(NM_010866)，采用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)，克隆小鼠MyoD基因，將其連接到pcDNA3.1(+)載體，獲得MyoD-pcDNA3.1真核表達(dá)載體;將獲得的MyoD-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染到小鼠胎兒成纖維細(xì)胞中，采用Real-Time PCR、免疫熒光、流式細(xì)胞分析等進(jìn)行活性檢測(cè)。其結(jié)果，MyoD-pcDNA3.1在小鼠胎兒成纖維細(xì)胞中具有表達(dá)活性;
　　2.MyoD-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞將

3、冷凍保存的綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約80％匯合時(shí)，分別進(jìn)行下列處理:1）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將MyoD-pcDNA3.1無內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中添加DMSO作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)（A組）;2）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染MyoD-pcDNA3.1無內(nèi)毒素質(zhì)粒（B組）;3）用添加有DMSO誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（C組）。在經(jīng)上述三種處理后，分別對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行如下檢測(cè):
　　(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)經(jīng)3種誘導(dǎo)處理后的第12d，

4、在倒置熒光顯微鏡下觀察，3組細(xì)胞均由長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變成細(xì)長(zhǎng)的成肌細(xì)胞狀態(tài)，即細(xì)長(zhǎng)管狀，旋渦狀逐漸消失。
　　(2)免疫熒光檢測(cè)在上述各組在開始處理后的第8d，利用MyoD和Desmin抗體進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果，雖然3種處理組細(xì)胞的MyoD均呈現(xiàn)陽性表達(dá)，但與A和B組相比，C組的MyoD表達(dá)量較低;3種處理組的細(xì)胞均表達(dá)Desmin，且其表達(dá)量無明顯差別;在第16d，利用MyoD、MyoG和Desmin抗體進(jìn)行檢測(cè)，在3種處理組的MyoD相對(duì)

5、表達(dá)量與第8d檢測(cè)時(shí)相比均有所下降，MyoG蛋白的表達(dá)量較弱，而Desmin的表達(dá)量與第8d檢測(cè)時(shí)相比無明顯差異。
　　(3)流式細(xì)胞檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果，上述3種處理組的細(xì)胞均表達(dá)成肌細(xì)胞特異因子MyoD、Desmin和MyoG，且3種蛋白的陽性細(xì)胞率均達(dá)到86.6％以上（A組分別為98.6％、99.0％和99.0％;B組分別為93.5％、99.5％和97.4％;C組分別為99.3％、99.5％和86.6％）。

6、　　(4) Real-Time PCR采用Real-Time PCR方法，對(duì)上述3種處理組細(xì)胞的MyoD、MyoG和Desmin的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果，與轉(zhuǎn)染前細(xì)胞（標(biāo)準(zhǔn)化為1）相比，上述3種處理組的MyoD、MyoG和Desmin的相對(duì)表達(dá)量與均升高（A組分別為3.217±0.01倍、4.345±0.01倍和5.107±0.01倍;B組分別為2.046±0.01倍、2.389±0.01倍和5.489±0.01倍;C組分別為3.7