FHIT基因?qū)W480人結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:近年來(lái)結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)。手術(shù)仍是治療的關(guān)鍵手段，而術(shù)后放、化療對(duì)提高生存率作用有限。因此，尋求新的結(jié)腸癌早期診斷和治療的方法對(duì)于提高其手術(shù)切除率和生存率，改善生活質(zhì)量具有重要的意義。隨著腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制已經(jīng)部份闡明，為結(jié)腸癌的基因治療提供了理論基礎(chǔ)。本課題組的前期研究證明脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）基因表達(dá)缺失在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，但目前其應(yīng)用于基因治

2、療總的效果仍不理想，許多還處于臨床前實(shí)驗(yàn)階段，加上人體基因表達(dá)機(jī)制十分復(fù)雜，到目前為止有些環(huán)節(jié)還不清楚，需要繼續(xù)深入研究，以便更好地發(fā)揮基因治療的作用。外源性FHIT基因轉(zhuǎn)染入FHIT基因表達(dá)缺失的結(jié)腸癌中誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制一旦明確，將為結(jié)腸癌的治療提供全新的分子治療策略。本研究擬通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000的介導(dǎo)下將基因工程技術(shù)構(gòu)建的真核表達(dá)載體pFHIT轉(zhuǎn)染入人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中，通過(guò)G418篩選、

3、濾紙片法結(jié)合有限稀釋法挑選單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，檢測(cè)SW480-FHIT、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pRc/CMV2的SW480-NEO細(xì)胞株以及野生型SW480細(xì)胞系的FHIT表達(dá)情況；觀察FHIT在體外對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及細(xì)胞周期和凋亡的影響；建立BALB/C NU裸鼠SW480皮下結(jié)腸癌模型，探討FHIT在體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。 第一部分構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)FHIT的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株 一．目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)FHIT的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株。

4、 二．方法 1．細(xì)胞培養(yǎng):SW480細(xì)胞復(fù)蘇后以含10%胎牛血清、高糖DMEM完全培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)。 2．真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染、G418篩選及挑選單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株:以陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)將FHIT表達(dá)載體質(zhì)粒pFHIT和空載體質(zhì)粒pRc/CMV2轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用梯度漸增法確定的含G418完全DMEM培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選。維持最適篩選濃度14天后用濾紙消

5、化法結(jié)合有限稀釋法挑選并擴(kuò)增單克隆細(xì)胞株。 3．RT-PCR及Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞FHIT表達(dá)的檢測(cè):Trizol法提取細(xì)胞總RNA，樣品進(jìn)行紫外分光光度儀檢測(cè)及1%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)判斷產(chǎn)量及質(zhì)量。RT-PCR檢測(cè)FHIT表達(dá)。PLC蛋白裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后孵育1抗、2抗，ECL發(fā)光法檢測(cè)目的FHIT蛋白表達(dá)。 三．結(jié)果 1．重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果:分別以FHIT

6、重組質(zhì)粒以及pRc/CMV2質(zhì)粒為模板，加入FHIT引物構(gòu)建PCR體系進(jìn)行特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)FHIT為模板組出現(xiàn)431bp的條帶，而pRc/CMV2則無(wú)相應(yīng)條帶。 2．真核載體轉(zhuǎn)染、G418篩選、有限稀釋法挑選單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株結(jié)果使用Lipofectamine2000陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)行真核細(xì)胞載體的轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的損傷較小，轉(zhuǎn)染效果滿意。對(duì)SW480細(xì)胞系來(lái)說(shuō)，含800μg/ml G418的完全DMEM培養(yǎng)基

7、為最佳篩選濃度，400μg/ml為合理維持濃度。從轉(zhuǎn)染成功并通過(guò)篩選的細(xì)胞中通過(guò)濾紙消化法和有限稀釋法挑選單克隆并建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。 3．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株FHIT表達(dá)評(píng)價(jià):分別以FHIT重組質(zhì)粒以及pRc/CMV2質(zhì)粒和空白SW480細(xì)胞株cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR，轉(zhuǎn)染FHIT重組質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組樣品可擴(kuò)增出FHIT產(chǎn)物條帶，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組樣品均未擴(kuò)增出FHIT產(chǎn)物條帶。而相應(yīng)的Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染FHIT的

8、細(xì)胞中有FHIT蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株和陰性對(duì)照均無(wú)目的條帶出現(xiàn)。三組均可擴(kuò)增出內(nèi)參GAPDH條帶。 四．結(jié)論：使用Lipofectamine2000陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)行真核細(xì)胞載體的轉(zhuǎn)染可以得到滿意的轉(zhuǎn)染效果。通過(guò)G418篩選、濾紙法結(jié)合有限稀釋法挑選單克隆，可以建立FHIT重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人結(jié)腸癌細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染了pFHIT的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株可以穩(wěn)定表達(dá)FHIT，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pRc/CMV2及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的SW480野

9、生型細(xì)胞均不表達(dá)FHIT。 第二部分FHIT對(duì)SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖影響的體外實(shí)驗(yàn) 一.目的：通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡改變，進(jìn)而分析FHIT基因轉(zhuǎn)染對(duì)SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。 二．方法 1．分組：挑選穩(wěn)定表達(dá)FHIT的轉(zhuǎn)染株（設(shè)定為SW480-FHIT）進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)；挑選不表達(dá)FHIT的pRc/CMV2轉(zhuǎn)染株（設(shè)定為SW480-NEO）為陰性對(duì)照組；

10、以未轉(zhuǎn)染的SW480為空白對(duì)照組。 2．觀察細(xì)胞形態(tài):使用光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)。 3．MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:將上述三組細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞量接種到96孔板，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，接種細(xì)胞后于不同的時(shí)間點(diǎn)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力改變，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 4．流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡:于6孔板內(nèi)接種上述三組細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合度時(shí)，胰酶消化法收取細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，PI染色

11、，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡變化，每組重復(fù)3次。 三．結(jié)果 1．細(xì)胞生長(zhǎng)情況:正常營(yíng)養(yǎng)、同等培養(yǎng)條件下，3組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)觀察顯示無(wú)明顯差異。 2、噻唑藍(lán)比色法（MTT）檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的變化:空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞SW480-Neo和親本細(xì)胞SW480增殖無(wú)顯著差異，相比之下，F(xiàn)HIT基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株SW480-FHIT較上述兩組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢，尤其是達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后更加明顯，差異顯著。

12、 3、SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染FHIT前后細(xì)胞周期和凋亡比率的變化：SW480-Neo和SW480細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡比率檢測(cè)均未見(jiàn)顯著差異，而SW480-FHIT細(xì)胞和上述兩組細(xì)胞對(duì)比，G2/M期和S期比例顯著下降，而G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加，且凋亡率高于較其它兩組。 四．結(jié)論：FHIT基因可以降低人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖能力，抑制其細(xì)胞周期并增加細(xì)胞的凋亡率。 第三部分FHIT對(duì)SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖影響

13、的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 一、目的：FHIT基因轉(zhuǎn)染對(duì)SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)增殖影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。 二、方法 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:60只SPF級(jí)4～5周齡雄性BALB/C NU裸鼠，隨機(jī)分為三組，每組20只，實(shí)驗(yàn)組接種SW480-FHIT，陰性對(duì)照組接種SW480-NEO，空白對(duì)照組接種SW480。 2．動(dòng)物模型的建立:常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量足夠并生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞鏡下計(jì)數(shù)，PBS重懸細(xì)胞制備

14、單細(xì)胞懸液，使活細(xì)胞濃度為5×107/ml。每只BALB/C NU裸鼠以0．2ml（即1×107個(gè)細(xì)胞）接種于右側(cè)背部皮下。 3．實(shí)驗(yàn)觀察:觀察腫瘤形成情況；接種后第10天開(kāi)始隔2天測(cè)量腫瘤體積，并繪制各組腫瘤生長(zhǎng)曲線。腫瘤體積（mm3）以公式0．5×a×b2計(jì)算，a（mm）為腫瘤長(zhǎng)徑，b（mm）為腫瘤短徑；待腫瘤體積至500mm3左右時(shí)每組隨機(jī)選取10只小鼠處死用于檢測(cè)，其余10只繼續(xù)培養(yǎng)，記錄生存時(shí)間，比較三組荷瘤小鼠的生存

15、期。 4．腫瘤標(biāo)本檢測(cè)內(nèi)容 （1）RT-PCR和Western Blot檢測(cè)腫瘤組織中FHIT表達(dá)。 （2）免疫組化檢測(cè)腫瘤組織FHIT、P53基因表達(dá)。 三、結(jié)果 1．FHIT對(duì)BALB/C NU裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響:在接種后7～10天，三組BALB/C NU裸鼠均可于皮下觸及腫瘤。腫瘤生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)SW480-FHIT組的腫瘤生長(zhǎng)比SW480組和SW480-NEO組的腫瘤生長(zhǎng)明顯為慢，對(duì)各時(shí)間點(diǎn)

16、的腫瘤體積進(jìn)行單因素方差分析，比較組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而兩對(duì)照組間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2．FHIT對(duì)BALB/C NU荷瘤裸鼠生存期的影響:SW480組的中位生存期為35天，950CI（30．868，39．132）； SW480-NEO組為37天，95%CI（35．482，38．518）； SW480-FHIT為48天，95%CI（43．868，52．132），三組的平均生存期分別為34．600±1．558、36．100±

17、1．479、50．700±3．685天。Log Rank法分析組間差異，見(jiàn)兩對(duì)照組間生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而實(shí)驗(yàn)組分別與兩對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3．腫瘤組織FHIT基因的表達(dá)情況:RT-PCR檢測(cè)結(jié)果提示SW480-FHIT組小鼠腫瘤組織中均有不同程度的FHIT基因表達(dá)，而Western Blot則表明FHIT蛋白有表達(dá)；相比之下，其它各組小鼠mRNA和蛋白水平均未檢測(cè)到FHIT表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示，SW480-