Axin基因和APC基因片段對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在西方國家，其發(fā)病率和死亡率均居第二位。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，90％以上的結(jié)直腸癌存在Wnt經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，該通路異常激活的標(biāo)志是β-catenin的穩(wěn)定和細(xì)胞核內(nèi)的積聚。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，APC基因的突變?yōu)閣nt通路激活最常見的原因。APC基因體細(xì)胞突變多發(fā)生在密碼子1250至1500間，產(chǎn)生截短蛋白，常喪失Axin的結(jié)合位點，進(jìn)而不能有效的降解β-catenin。另一方面，有實驗表

2、明，與APC結(jié)合的Axin比Axin自身更能有效地誘導(dǎo)β-catenin的降解。APC和Axin的相互作用在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，將外源性的野生型APC基因?qū)階PC突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞，可導(dǎo)致β-catenin的降解，下調(diào)β-catenin的水平。此外，將野生型Axin基因?qū)階PC或Axin突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞亦可導(dǎo)致β-catenin降解及腫瘤細(xì)胞凋亡。野生型APC和Axin基因單獨(dú)導(dǎo)入結(jié)直腸癌細(xì)胞已經(jīng)被證實能夠下調(diào)

3、β-catenin水平及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，而將兩者共同導(dǎo)入體內(nèi)有望取得更強(qiáng)的抑瘤效果但還有待更多的研究證實。由于APC基因全長大于10kb，直接用于基因治療的操作性較困難。本課題組在前期實驗中根據(jù)APC的功能結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增出5條功能片段并構(gòu)建了5個重組質(zhì)粒，結(jié)果證實攜帶APC5(aa1020-1698)基因片段的重組質(zhì)粒pEGFP-N3/APC5最能有效降低β-catenin表達(dá)且基因片段較小。
　　 目的：建立穩(wěn)定表達(dá)APC5的結(jié)

4、腸癌細(xì)胞株，驗證APC5基因片段是否具有負(fù)性調(diào)控wnt信號途徑及抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能，通過研究Axin基因共轉(zhuǎn)APC5穩(wěn)定細(xì)胞株產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，明確APC5基因片段與Axin基因共同作用在體外抑瘤方面是否優(yōu)于APC5單獨(dú)作用，為結(jié)直腸癌的聯(lián)合基因治療提供實驗依據(jù)。
　　 方法：(1)對攜帶野生型Axin基因的重組質(zhì)粒pCS2-MT/Axin和攜帶APC5基因片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化、提取、雙酶切及測序鑒定。(2)將重組質(zhì)粒pE

5、GFP-N3/APC5用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染入人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480，經(jīng)過G418篩選，多次采用有限稀釋法連續(xù)克隆化，獲得表達(dá)目的基因APC5的穩(wěn)定細(xì)胞株。通過觀察細(xì)胞克隆中綠色熒光蛋白的表達(dá)及Western blot法檢測陽性克隆中標(biāo)簽蛋白GFP的表達(dá)，明確重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后能否在腫瘤細(xì)胞中正確表達(dá)從而發(fā)揮作用。(3)用MTT法計算穩(wěn)定細(xì)胞株的生長抑制率、RT-PCR法檢測重組質(zhì)粒pEGFP-N3/APC5對wnt信號通路的關(guān)鍵分子β-ca

6、tenin及下游靶基因c-myc、survivin和cyclinD1 mRNA表達(dá)水平的影響，證實APC5片段是否具有負(fù)性調(diào)控wnt通路及抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能。(4)將Axin基因共轉(zhuǎn)染表達(dá)APC5的穩(wěn)定細(xì)胞株，通過MTT法計算細(xì)胞生長抑制率、RT-PCR檢測wnt通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，設(shè)表達(dá)APC5的穩(wěn)定細(xì)胞株作對照。Western blot法檢測wnt通路相關(guān)基因蛋白的表達(dá)、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，設(shè)APC5單轉(zhuǎn)組、轉(zhuǎn)染空載

7、體組及未轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞為對照。使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果：(1)pCS2-MT/Axin經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見一大小約2.5kb的目的片段和4.3kb的載體片段；重組質(zhì)粒pEGFP-N3/APC5經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見一條大小約2.0kb的目的片段和一條4.7kb的載體片段，片段大小與預(yù)期相符，測序結(jié)果正確無誤。(2)pEGFP-N3/A

8、PC5轉(zhuǎn)染細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中長出多個耐藥克隆，所有克隆在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白表達(dá)。western blot法在所有克隆中檢測到標(biāo)簽蛋白的表達(dá)。(3)MTT結(jié)果顯示：空載體轉(zhuǎn)染組和空白對照組的抑制率分別為2.9％和0.0％，兩組穩(wěn)定細(xì)胞株SW480/Axin的生長抑制率較大，分別為41.3％和35％，后兩組與前面兩組比較，差異非常顯著(P＜0.01)；Axin共轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞株SW480/APC5后，同空載體pCS2-MT共轉(zhuǎn)SW4

9、80/APC5組（抑制率4.9％）及SW480/APC5組（抑制率0.0％）相比，兩組SW480/APC5-Axin共轉(zhuǎn)細(xì)胞的生長抑制率較大（分別為31.4％,41.7％），差異有顯著性(P＜0.05)。(4)RT-PCR結(jié)果：在各組細(xì)胞中，瓊脂糖凝膠電泳顯示，分別在約330bp、310bp、300bp、340bp處可見清晰的單一條帶，與目的基因β-catenin、c-myc、survivin和cyclinD1的分子量大小相符。對目的條

10、帶與內(nèi)參條帶的灰度比值行單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。結(jié)果顯示：空白SW480細(xì)胞和僅轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N3的SW480細(xì)胞之間、兩組SW480/APC5細(xì)胞之間RT-PCR電泳條帶灰度比值間的差異無顯著性(p＞0.05)，而后兩組條帶的灰度比值同前相比，比值較小，差異有顯著性(p＜0.05)。Axin共轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞株SW480/APC5后，與SW480/APC5-vector組及SW480/APC5組相比，兩組SW480/A

11、PC5-Axin細(xì)胞的電泳條帶灰度比值較小，差異有顯著性(p＜0.05)(5)Western blot結(jié)果：在各組細(xì)胞中，均檢測到特異條帶，與目的基因的分子量大小相符。對Western blot電泳條帶的灰度比值進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，結(jié)果顯示：空白SW480細(xì)胞組和SW480/vector-vector組電泳條帶灰度比值之間的差異無顯著性(p＞0.05)；SW480/APC5組電泳條帶灰度比值較小，同前兩組比較，差異有

12、顯著性(P＜0.05)；SW480/APC5-Axin組電泳條帶灰度值最小，同前面三組的任意一組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。(6)流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析顯示：分別轉(zhuǎn)染空載體、APC5、APC5-Axin的細(xì)胞中，后2種方式的轉(zhuǎn)染均能引起細(xì)胞不同程度滯留于G1/S期。與APC5單基因轉(zhuǎn)染組相比，共轉(zhuǎn)染基因組G1/S期比例最大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：成功建立了穩(wěn)定表達(dá)APC5基因片段的人結(jié)腸