沉默Smurf1對結(jié)腸癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：
　　1、構(gòu)建Smurf1 shRNA真核表達載體。
　　2、分析沉默Smurf1對結(jié)腸癌細(xì)胞系增殖、遷移、侵襲和EMT轉(zhuǎn)化的影響。
　　方法：
　　1.Smurf1 shRNA載體的構(gòu)建用BamHⅠ和HindⅢ將pSilencer4.1質(zhì)粒和Smurf1同時進行雙酶切后，T4 DNA ligase連接;測序驗證。
　　2 Smurf1 shRNA轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系將脂質(zhì)體和干擾質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染入復(fù)蘇好的結(jié)

2、腸癌細(xì)胞中。
　　3.Smurf1 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的篩選確定篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的G418濃度，并篩選出Smurf1 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　4.Western blot驗證轉(zhuǎn)染是否成功檢測Smurf1蛋白表達，確定轉(zhuǎn)染效果。
　　5.MTT分析shRNA對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞增殖情況。
　　6.Smurf1 shRNA對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響劃痕實驗檢測結(jié)腸癌細(xì)胞遷移情況。
　　

3、7 Smurf1 shRNA對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的影響Transwell實驗檢測結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲情況。
　　8下調(diào)Smurf1對結(jié)腸癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的影響Western blot檢測E-cadherin蛋白和Vimentin蛋白的表達水平降低反映結(jié)腸癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化情況。
　　結(jié)果：
　　1、Smurf1 shRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2、與對照組相比，轉(zhuǎn)染有干擾載體的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480隨著時間的

4、增加細(xì)胞的增殖速率降低。
　　3、轉(zhuǎn)染shRNA重組質(zhì)粒的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力下降。
　　4、Transwell實驗證明轉(zhuǎn)染干擾載體后，結(jié)腸癌細(xì)胞穿越濾膜的細(xì)胞數(shù)目降低。
　　5、結(jié)腸癌細(xì)胞中的Smurf1表達下調(diào)，增加了E-cadherin的表達水平，降低了Vimentin和Twist的表達水平。
　　結(jié)論：
　　1、成功的構(gòu)建了Smurf1干擾載體，該載體能夠抑制Smurf1的表達。
　　2、結(jié)腸癌