SOX9基因沉默對大腸癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響.pdf

1、大腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一。隨著人類基因組計劃的完成和基因技術(shù)的不斷進(jìn)步,基因治療已成為大腸癌治療的新熱點(diǎn),并從理論走向?qū)嵺`,其有效性已在細(xì)胞學(xué)和動物模型上得到驗(yàn)證。1998年RNA干擾(RNA interference,RNAi)的發(fā)現(xiàn)[1],特別是在哺乳動物細(xì)胞應(yīng)用小干擾RNA成功介導(dǎo)RNAi,為腫瘤的治療提供了強(qiáng)有力的工具。
　　 對于RNAi在大腸癌基因治療中的應(yīng)用來講,靶點(diǎn)的選擇是最重要的。SOX9基因是我

2、們實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用生物信息學(xué)方法在結(jié)直腸癌正常粘膜和其配對癌組織中首次篩選到的一個在大腸癌中表達(dá)上調(diào)的蛋白,并經(jīng)半定量RT-PCR、實(shí)時熒光定量PCR、免疫印跡、免疫組織化學(xué)反饋性驗(yàn)證。同時免疫組織化學(xué)結(jié)果表明SOX9高表達(dá)是一個獨(dú)立的預(yù)后不良指標(biāo)[2,3]。另外已有研究支持SOX9是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游基因[4,5],其可能通過抑制細(xì)胞分化參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。因此我們推測SOX9很可能是大腸癌發(fā)生、發(fā)展中一個新的促癌基因。SOX是一

3、類SRY(sex determination region of Y chromosome)相關(guān)基因構(gòu)成的控制發(fā)育的基因家族,編碼一系列SOX家族的轉(zhuǎn)錄因子,其所有成員的共同特點(diǎn)是含有一個高度保守的HMG-box(highmobilitygroupbox)DNA結(jié)合域[6,7]。SOX9可能是目前SOX家族中研究最為廣泛的轉(zhuǎn)錄因子之一,是人體早期胚胎發(fā)育重要的相關(guān)基因,該基因的突變或重復(fù)可導(dǎo)致性別反轉(zhuǎn)或CD綜合癥[8,9]。近年來研究發(fā)

4、現(xiàn)SOX9在脊椎動物的發(fā)育過程中起著重要作用[10],尤其在骨骼、生殖腺、神經(jīng)膠質(zhì)以及心臟的發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能,同時SOX9的異常表達(dá)可能與人類多種腫瘤有關(guān),研究顯示SOX9在大腸癌[11-13]、軟骨肉瘤[14,15]、前列腺癌[16-18]、乳腺癌[19-23]、卵巢癌[24-25]、肺癌[26-27]、基底細(xì)胞癌[28]、膀胱癌[29]及黑色素瘤[30,31]等腫瘤組織中表達(dá)異常,并與腫瘤細(xì)胞的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡等密切相

5、關(guān)。
　　 SOX9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)相對于正常組織來說較高,并且結(jié)直腸癌細(xì)胞系中SOX9的表達(dá)也較高,這個現(xiàn)象可能預(yù)示著SOX9表達(dá)升高可能與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。這個現(xiàn)象給了我們一個思路:將高表達(dá)SOX9的結(jié)直腸癌細(xì)胞通過RNAi方法使得SOX9的表達(dá)降低后,這些細(xì)胞會產(chǎn)生怎樣的變化?我們選用了具備不同遺傳學(xué)背景的SW480和RKO細(xì)胞作為我們的細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建SOX9干擾質(zhì)粒載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞及穩(wěn)篩的方法沉默結(jié)直腸癌細(xì)胞

6、中SOX9的表達(dá),并分別對SW480和RKO的空白對照組(B)、空質(zhì)粒組(E)及轉(zhuǎn)染組(S)的生物學(xué)行為進(jìn)行了檢測分析,包括細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、凋亡相關(guān)檢測、遷移實(shí)驗(yàn),并建立裸鼠人大腸癌移植模型,體內(nèi)評價SOX9基因沉默對大腸癌實(shí)體瘤的靶向抑瘤效果,為SOX9作為臨床基因治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù).
　　 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示:轉(zhuǎn)染了SOX9干擾質(zhì)粒的SW480和RKO細(xì)胞的生長速度要明顯慢于空白對照組和轉(zhuǎn)染空載體對照組。并且通過實(shí)時定

7、量儀檢測細(xì)胞增殖速度,同樣得到RKOS和SW480S組細(xì)胞相對于對照組增殖速度減慢。提示細(xì)胞中SOX9表達(dá)上調(diào)后可能通過加快細(xì)胞的增殖速率促進(jìn)腫瘤的形成。
　　 PI/AnnexinV雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染了SOX9干擾質(zhì)粒的SW480和RKO細(xì)胞凋亡率都明顯增高,提示SOX9的沉默在結(jié)直腸癌細(xì)胞中可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明:SOX9對結(jié)直腸癌SW480的遷移能力沒有影響。
　　 裸鼠成