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文檔簡介
1、目的:通過大腸癌體外細胞模型,利用RNA干擾技術,探討ATM基因沉默是否對大腸癌HT29細胞的放射敏感性有影響。
方法:設計并構建ATM基因小分子干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)真核表達質粒pSilencer2.1-ATM,并轉染人大腸癌HT29細胞株作為陽性組;ATM基因RNAi寡聚脫氧核糖核酸序列隨機重新排列后構建非特異性siRNA,并轉染pSilencer2.1-nonspecific
2、質粒作為陰性組,未轉染為對照組。各組分別采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測各組ATM基因的mRNA含量,蛋白質免疫印跡法(Western blot,WB)檢測每組ATM基因mRNA表達的蛋白質含量,各組細胞經8GyX線照射后,分成兩部分,分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h,然后采用流式細胞儀檢測不同時間點(24 h、48h)的陽性組、陰
3、性組以及對照組的細胞周期分布和細胞凋亡情況。
結果:ATM基因siRNA真核重組表達質粒構建后成功轉染大腸癌HT29細胞。RT-PCR檢測證實陽性組ATM基因的mRNA含量明顯下降;Western blot結果證實陽性組細胞ATM基因所表達蛋白量明顯減少。經X線照射后24h,陽性組G1+G0期、G2+M期細胞比例較對照組均減少(t=-11.59,P<0.001;t=-4.30,P<0.001),但陰性組與對照組相比無明顯差別(
4、t=0.02,P=0.98;t=-0.03,P=0.97);照射48h后,G1+G0期、G2+M期細胞比例同樣較對照組減少(t=-9.91,P<0.001;t=-4.94,P<0.001),陰性組與對照組同樣無明顯差別(t=0.08,P=0.94; t=0.09,P=0.93);照射后24、48 h陽性組細胞凋亡率均高于對照組(t=21.15,P<0.001;t=32.94,P<0.001),陰性組與對照組相比無明顯差別(t=1.56,
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