沉默BMI-1、RNF2基因?qū)κ彻荀[癌細胞放射敏感性的影響.pdf

1、第一部分：BMI-1、RNF2基因在食管鱗癌組織中的表達及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系
　　目的：食管鱗狀細胞癌（esohaphageal squamous cell carcinoma，ESCC）是嚴重威脅人類生命及健康的癌癥之一。放療是中晚期食管鱗癌患者重要的治療方法，然而，由于放射抵抗性的存在，部分患者的預(yù)后仍很差。B細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點-1（B-cell-specific Moloney murine le

2、ukemia virus integration site-1，BMI-1）和環(huán)指蛋白2（RING finger protein，RNF2）均屬于多梳基因家族（polycomb group，PcG）成員，在多種惡性腫瘤中高表達，本文旨在通過檢測 BMI-1和 RNF2在 ESCC組織及相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中的表達變化，分析其與患者臨床病理特征及術(shù)后生存時間的關(guān)系。
　　方法：
　　1.采用免疫組織化學技術(shù)檢測人食管鱗癌組織及

3、相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中BMI-1和RNF2的表達。
　　2.通過Western blotting方法檢測人食管鱗癌組織及相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中BMI-1和RNF2蛋白的表達水平。
　　3.分析BMI-1和RNF2表達與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組織化學方法檢測BMI-1和RNF2表達變化
　　免疫組織化學分析結(jié)果顯示，BMI-1和RNF2蛋白主要定位于腫瘤細胞的細胞核。60例食

4、管鱗癌組織中，BMI-1陽性表達32例，表達率為53.33％；60例相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中，BMI-1蛋白陽性表達5例，表達率為8.33%。64例食管鱗癌組織中，RNF2蛋白陽性表達35例，表達率為54.69%；64例相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中，RNF2蛋白陽性表達7例，表達率為10.94%。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，癌組織中BMI-1、RNF2蛋白的表達水平明顯高于相應(yīng)的癌旁正常粘膜組織（P<0.001）。
　　2.Western blott

5、ing檢測BMI-1和RNF2的蛋白表達變化
　　Western blotting檢測124例食管鱗癌患者癌組織內(nèi)BMI-1、RNF2蛋白表達情況，結(jié)果顯示與癌旁正常粘膜組織相比，食管鱗癌組織內(nèi)BMI-1、RNF2蛋白表達量均明顯高于癌旁正常粘膜組織中的表達量，分別為0.317±0.098 vs1.032±0.210、0.206±0.028 vs1.070±0.153，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與免疫組化的檢測結(jié)果一致

6、。
　　3.BMI-1、RNF2與食管鱗癌患者的臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系
　　食管鱗癌組織中 BMI-1、RNF2蛋白的表達高低與腫瘤大?。≒＝0.022，P＝0.024）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.011，P＝0.015）及TNM分期（P＝0.021，P＝0.027）密切相關(guān)，與患者年齡、性別、組織學分級等參數(shù)的差異均未見統(tǒng)計學意義（P>0.05）； Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示， BMI-1、RNF2陽性表達者的總

7、生存率明顯低于陰性表達者，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；BMI-1陽性表達者和陰性表達者的3年生存率分別為18.80%和58.30%，中位生存時間分別為14個月和26個月。RNF2陽性表達者和陰性表達者的3年生存率分別為14.30%和48.30%，中位生存時間分別為15個月和24個月。
　　結(jié)論：
　　1.在人食管鱗癌組織中BMI-1和RNF2蛋白高表達。
　　2.BMI-1和RNF2在食管鱗癌組織中的表達水平

8、與腫瘤惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后有關(guān)，為食管鱗癌患者分子靶向治療提供新思路。
　　第二部分：沉默BMI-1、RNF2基因?qū)w外食管鱗癌細胞放射敏感性的影響
　　目的：通過靶向沉默BMI-1和RNF2基因，研究BMI-1和RNF2蛋白表達對食管鱗癌細胞 X線照射后的增殖水平、遷移能力、細胞周期分布及凋亡等生物學特性的影響及與 DNA損傷修復(fù)基因的關(guān)系，探討B(tài)MI-1和RNF2對食管鱗癌細胞放射敏感性的調(diào)控。
　　

9、方法：
　　1.采用Western blotting方法檢測人食管鱗癌細胞系TE13、KYSE30、ECA109和KYSE170中BMI-1和RNF2蛋白的表達水平。
　　2.構(gòu)建敲低BMI-1和 RNF2的真核表達載體（pGLV3-H1-BMI-1和pGLV3-H1-RNF2），分別轉(zhuǎn)染食管鱗癌 ECA109和 TE13細胞株，用嘌呤霉素進行篩選，挑取單克隆擴大培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定BMI-1和RNF2低表達的ECA109-shB

10、MI-1（ECA109-shRNF2）和 TE13-shBMI-1（TE13-shRNF2）細胞及各自陰性對照的ECA109-NC和TE13-NC細胞。分別采用qRT-PCR和Western blotting方法檢測BMI-1和RNF2基因的沉默效率。
　　3.分別采用MTS法和克隆形成實驗檢測沉默BMI-1和RNF2基因表達后對食管鱗癌細胞增殖水平和放射敏感性的影響。
　　4.采用Transwell遷移實驗檢測沉默BMI-

11、1和RNF2基因表達后對食管鱗癌細胞遷移能力的影響。
　　5.應(yīng)用 Western blotting法檢測 BMI-1、RNF2及其下游γH2AX和H2AK119ub在不同食管鱗癌細胞系中隨照射時間和照射劑量的變化情況；采用激光共聚焦檢測上述蛋白在細胞核內(nèi)斑點隨照射時間和照射劑量變化的分布。采用免疫共沉淀方法檢測 BMI-1、RNF2與γH2AX、H2AK119ub之間的關(guān)系。
　　6.采用流式細胞技術(shù)檢測沉默BMI-1和R

12、NF2基因表達后對各組食管鱗癌細胞周期分布及細胞凋亡的影響。
　　7.采用Western blotting方法檢測細胞周期相關(guān)蛋白（CDK4、Cycle D2、P16）和細胞凋亡相關(guān)蛋白（bcl-2、bax）的表達。
　　結(jié)果：
　　1.BMI-1和RNF2在不同食管鱗癌細胞系中的表達
　　Western blotting檢測結(jié)果顯示，BMI-1和RNF2蛋白在4種食管鱗癌細胞系TE13、KYSE30、ECA10

13、9和 KYSE170中均有不同程度的表達。其中，BMI-1和RNF2蛋白在ECA109和TE13細胞系中的表達量相對較高（P<0.01）。
　　2.BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞沉默效果
　　為了檢測BMI-1和RNF2對食管鱗癌放射敏感性的影響，選擇BMI-1和 RNF2表達量相對較高的ECA109和 TE13細胞株進行基因沉默。qRT-PCR和 Western blotting檢測結(jié)果顯示，

14、與 ECA109-control、ECA109-NC細胞相比，ECA109-shBMI-1細胞中BMI-1 mRNA和蛋白的表達水平明顯降低（P<0.01）。同樣，TE13-shBMI-1細胞中BMI-1 mRNA和蛋白的表達水平明顯低于TE13-control、TE13-NC細胞（P<0.01）。RNF2 mRNA和蛋白在ECA109和TE13細胞中的表達情況與BMI-1結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMI-1 shRNA和RNF2

15、 shRNA均有效抑制了BMI-1和RNF2基因在ECA109和TE13細胞中的表達。
　　3.沉默BMI-1和RNF2對食管鱗癌細胞增殖水平和克隆形成的影響
　　MTS檢測發(fā)現(xiàn)，未行X線照射時，細胞培養(yǎng)24h、48h、72h后，轉(zhuǎn)染BMI-1 shRNA或轉(zhuǎn)染RNF2 shRNA的ECA109和TE13細胞的吸光度值均顯著低于各自control、NC組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），照射后48h、72h這種趨勢更明

16、顯（P<0.01）。克隆形成實驗顯示，BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組細胞的D0、Dq、SF2值均明顯低于control與NC組，外推數(shù)N值顯著高于control與NC組（P<0.05）。control與NC組細胞放射敏感性的差異未見統(tǒng)計學意義（P>0.05），而 BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組細胞的放射敏感性明顯高于control與NC組（P<0.05）。
　　4.沉默BMI-1和RNF2對食管鱗癌

17、細胞遷移能力的影響
　　Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，各組細胞培養(yǎng)24h后，穿過基底膜的ECA109-BMI-1 shRNA和ECA109-RNF2 shRNA組細胞數(shù)明顯低于穿過基底膜的control與 NC組細胞數(shù)（P<0.05）。此外，穿過基底膜的TE13-BMI-1 shRNA和TE13-RNF2 shRNA組細胞數(shù)也明顯低于穿過基底膜的control與NC組細胞數(shù)（P<0.05）。
　　5.BMI-1、RNF

18、2與DNA損傷修復(fù)基因的關(guān)系
　　Western blotting檢測結(jié)果顯示，BMI-1、RNF2與H2AK119ub、γH2AX蛋白隨著照射劑量的增加而增加，在6Gy照射后1~2h三種蛋白表達量最高，隨后逐漸下降，24h接近照射前水平，三種蛋白的變化趨勢一致，存在時間依賴性和劑量依賴性。激光共聚焦結(jié)果顯示，γH2AX與BMI-1、RNF2在細胞核內(nèi)的斑點數(shù)量隨著照射劑量的增加而增加；此外，在6Gy照射后1~2h核內(nèi)斑點達到峰值

19、，隨后逐漸減少，24h接近照射前水平，三者隨照射劑量和照射后時間變化的規(guī)律基本一致。免疫共沉淀結(jié)果顯示，照射前BMI-1、RNF2蛋白的表達與H2AK119ub、γH2AX蛋白表達未見明顯相關(guān)性，而照射后H2AK119ub、γH2AX表達均與BMI-1、RNF2蛋白表達密切相關(guān)。
　　6.沉默BMI-1和RNF2對照射前、后食管鱗癌細胞周期分布的影響
　　未照射時各組細胞的細胞周期中各期比例的差異均未見統(tǒng)計學意義（P>0.0

20、5）。而照射后各組 G0/G1期細胞比例均較照射前明顯減低（P<0.05），且BMI-1 shRNA、RNF2 shRNA組G0/G1期細胞比例明顯高于control與NC組（P<0.01）；照射后各組G2/M期細胞比例均明顯高于相應(yīng)未照射組（P<0.05），且照射后BMI-1 shRNA、RNF2 shRNA組G2/M期細胞比例明顯低于control與NC組（P<0.01）。照射前、后各組處于S期細胞比例的差異均未見統(tǒng)計學意義（P>0

21、.05）。
　　7.沉默BMI-1和RNF2基因?qū)φ丈淝?、后食管鱗癌細胞凋亡的影響
　　結(jié)果顯示，照射后各組細胞凋亡率均明顯高于相應(yīng)未照射組（P<0.05）。照射前BMI-1 shRNA組細胞凋亡率較control與NC組高，但差異未見統(tǒng)計學意義（P>0.05），照射后BMI-1 shRNA組細胞凋亡率明顯高于control與NC組（P<0.01）；照射前，RNF2 shRNA組細胞凋亡率顯著高于control和NC組，差異

22、具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），照射后這種趨勢更明顯（P<0.01）。
　　8.沉默BMI-1和RNF2基因?qū)κ彻荀[癌細胞周期相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的影響
　　1)沉默BMI-1和RNF2基因?qū)φ丈淝?、后食管鱗癌細胞表達Cyclin D2、CDK4、P16的影響
　　Western blotting結(jié)果顯示，照射后各組細胞中Cyclin D2、CDK4、P16蛋白表達明顯高于相應(yīng)未照射組（P<0.05）。與contro

23、l和NC組相比，照射前BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組細胞中Cyclin D2、CDK4蛋白的表達水平顯著降低，而P16蛋白的表達水平明顯升高（P<0.05），照射后這種趨勢更明顯（P<0.01）。
　　2)沉默BMI-1和RNF2基因?qū)φ丈淝?、后食管鱗癌細胞表達bcl-2、bax的影響
　　研究結(jié)果顯示，照射后各組細胞中bcl-2、bax蛋白表達明顯高于相應(yīng)未照射組（P<0.05）；與control與NC組相

24、比，照射前BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組bcl-2蛋白的表達水平顯著下降，而bax蛋白的表達水平明顯上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），照射后這種趨勢更明顯更明顯（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.沉默 BMI-1和 RNF2基因表達可將食管鱗癌細胞周期阻滯于G0/G1期，誘導了腫瘤細胞的凋亡，從而有效抑制了食管鱗癌細胞的增殖水平和遷移能力，促進了食管鱗癌細胞的放射敏感性。
　　2.BMI-1

25、和 RNF2對細胞周期分布和細胞凋亡的調(diào)控通過與H2AK119ub、γH2AX相互作用以調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達來實現(xiàn)。
　　第三部分：沉默BMI-1、RNF2基因?qū)θ耸彻荀[癌細胞裸鼠移植瘤體內(nèi)放射增敏效應(yīng)的觀察
　　目的：建立裸鼠移植瘤模型觀察BMI-1和RNF2基因沉默后食管鱗癌細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤效應(yīng)，并分析其分子改變，以探討 BMI-1和RNF2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。
　　方法：

26、>　　1.分別以 TE13-control、TE13-pGLV3-H1、TE13-BMI-1 shRNA和TE13-RNF2 shRNA細胞接種BALB/c/nu裸鼠，建立裸鼠移植瘤模型，觀察裸鼠成瘤及皮下腫瘤生長情況。
　　2.在裸鼠移植瘤長至直徑約為0.8~1.0cm時照射裸鼠，照射后24 h處死，Western blotting法檢測腫瘤組織內(nèi)BMI-1和RNF2蛋白的表達。
　　3.TUNEL方法檢測各組荷瘤裸鼠腫瘤

27、組織的凋亡情況。
　　4.免疫組織化學方法檢測各組荷瘤裸鼠腫瘤組織中BMI-1、RNF2及凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax的表達。
　　結(jié)果：
　　1.沉默BMI-1和RNF2基因?qū)δ[瘤成瘤和移植瘤生長抑制的影響
　　觀察后發(fā)現(xiàn)，NC組對裸鼠移植瘤的生長未見顯著影響，而沉默BMI-1或RNF2基因后，裸鼠移植瘤生長緩慢，腫瘤體積較小，與control、NC組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），照射后這種趨勢更

28、明顯。control與NC組裸鼠移植瘤生長速度最快，沉默BMI-1或RNF2后移植瘤生長速度減慢，照射后移植瘤生長速度更慢，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。NC組、NC+照射組、BMI-1 shRNA組、BMI-1 shRNA+照射組、RNF2 shRNA組、RNF2 shRNA+照射組移植瘤的生長抑制率分別為：8.22%、52.52%、29.71%、76.26%、33.42%、75.73%，沉默BMI-1或RNF2聯(lián)合照射組裸鼠腫

29、瘤的體積、重量均明顯減低，表明采用RNA干擾技術(shù)降低腫瘤細胞中BMI-1和RNF2蛋白的表達，在體內(nèi)確實發(fā)揮了放射增敏作用。
　　2.體內(nèi)BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞的沉默效果Western blotting結(jié)果顯示，沉默BMI-1或RNF2基因組裸鼠移植瘤中BMI-1和RNF2蛋白表達水平明顯降低（P<0.01），體內(nèi)實驗沉默BMI-1、RNF2蛋白表達的效果明顯，沉默效率分別為66.67%和68

30、.21%。
　　3.沉默BMI-1或RNF2對裸鼠移植瘤組織凋亡的影響
　　TUNEL法檢測剝離腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，照射后各組移植瘤的凋亡水平均明顯高于其照射前凋亡水平，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。此外，照射前BMI-1 shRNA或RNF2 shRNA組移植瘤的凋亡水平均顯著高于control與NC組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），照射后這種趨勢更明顯。表明BMI-1或RNF2敲低聯(lián)合放射線照射能誘導移植瘤組織的凋

31、亡，從而促進了腫瘤細胞對放射線的敏感性。
　　4.腫瘤組織標本中BMI-1和RNF2蛋白的表達
　　免疫組織化學研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMI-1和RNF2蛋白主要在細胞核表達，而較少在細胞漿表達。與照射前相比，照射后各組腫瘤組織中 BMI-1和RNF2蛋白的表達水平稍高，但差異均未見統(tǒng)計學意義（P>0.05）；此外，照射前BMI-1 shRNA或RNF2 shRNA組細胞中BMI-1和RNF2蛋白的表達水平均明顯低于control與N

32、C組（P<0.05），照射后這種趨勢更明顯。
　　5.腫瘤組織標本中凋亡相關(guān)蛋白的表達
　　免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，照射后各組bcl-2蛋白的表達水平均顯著低于相應(yīng)的未照射組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與control、NC組相比，照射前BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組bcl-2蛋白的表達水平均明顯下降（P<0.05）；與control或NC聯(lián)合照射組相比，BMI-1 shRNA或RNF2 shRN

33、A聯(lián)合照射組bcl-2蛋白的表達水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　照射后各組bax蛋白的表達水平均顯著高于相應(yīng)的未照射組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與control、NC組相比，照射前BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組bax蛋白的表達水平均明顯升高（P<0.05）；與control或NC聯(lián)合照射組相比，BMI-1 shRNA或RNF2 shRNA聯(lián)合照射組bax蛋白的表達水平均顯著增加