siRNA沉默TPX2對人宮頸癌HeLa細胞放射敏感性的影響.pdf

1、目的：對于分期較晚不考慮外科治療的宮頸癌患者，主要的治療手段之一是放療。腫瘤細胞對射線殺傷是否敏感直接決定了療效和疾病預(yù)后。DNA修復(fù)蛋白與腫瘤的放射敏感性關(guān)系密切。TPX2主要在胞核中起作用，依賴細胞周期并受其調(diào)節(jié)，與有絲分裂中紡錘體的準(zhǔn)確合成及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有直接關(guān)系。TPX2基因異常表達直接產(chǎn)生的結(jié)果是中心體出現(xiàn)反常擴增及異倍體形成，同時與腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)明顯相關(guān)。已有研究證實了射線依賴的H2AX形成量與DNA雙鏈斷裂點的數(shù)量之間有相關(guān)關(guān)

2、系。最新的研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)TPX2蛋白發(fā)生不同程度的消耗時，射線誘導(dǎo)的H2AX的數(shù)量會呈現(xiàn)短暫增加的現(xiàn)象。本實驗主要利用RNAi技術(shù)，設(shè)計合成靶基因TPX2的小干擾 RNA，觀察導(dǎo)入siRNA后HeLa細胞中TPX2 mRNA和蛋白表達的改變，以及HeLa細胞放射敏感性的變化，為宮頸癌的放射增敏提供了研究方向。
　　方法：選擇人宮頸癌 HeLa細胞，根據(jù)小干擾 RNA設(shè)計原則設(shè)計靶基因 TPX2的siRNA，共設(shè)計3對分別為siRNA

3、-1、siRNA-2和siRNA-3，同時設(shè)計陰性對照siRNA。利用 riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑，將siRNA轉(zhuǎn)染入HeLa細胞，對轉(zhuǎn)染后各組細胞內(nèi)TPX2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達情況進行觀察。主要采用RT-PCR、 Western Blotting法，于轉(zhuǎn)染后48 h進行，提取總RNA和總蛋白后檢測TPX2 mRNA和蛋白表達情況，并篩選出最佳轉(zhuǎn)染組及最佳轉(zhuǎn)染時間。實驗分組：目的基因組、陰性對照組、空白對照組。利用riboFE

4、CTTMCP將siRNA轉(zhuǎn)染入宮頸癌HeLa細胞中進行4 Gy-X線照射，利用CCK8法和流式細胞術(shù)觀察TPX2表達下調(diào)的HeLa細胞對射線的敏感性的改變。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染48 h后提取總RNA，利用RT-PCR觀察轉(zhuǎn)染后各組細胞TPX2 mRNA的相對表達量發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染針對靶基因TPX2的siRNA的各組細胞均表現(xiàn)出TPX2基因表達抑制效應(yīng)，以siRNA-2效果最明顯，其TPX2的相對含量為（0.133±0.008）與空白對照組（

5、1.000）及陰性對照組（0.981±0.814）相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用Western Blot法檢測HeLa細胞TPX2蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA-2組TPX2蛋白表達明顯降低，蛋白相對含量為（0.518±0.685），空白對照組為（1.064±0.794），陰性對照組為（0.981±0.814），siRNA-2組與陰性對照組及空白對照組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HeLa細胞放射敏感

6、性的檢測：轉(zhuǎn)染后給予4 Gy X線照射，①利用CCK8檢測各組細胞OD值，并計算細胞增殖活力，沉默 TPX2組為（0.147±0.003），陰性對照組為（0.224±0.009），空白對照組為（0.353±0.012），統(tǒng)計學(xué)分析得出F=9.243，P=0.0015，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；②用流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)各組細胞均出現(xiàn)凋亡增加，其中沉默TPX2組細胞凋亡率為（12.68±0.03%），陰性對照組為（9.3