利用siRNA沉默PCNA研究對(duì)宮頸癌生長(zhǎng)的影響.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文利用siRNA沉默PCNA研究對(duì)宮頸癌生長(zhǎng)的影響姓名：黃浩申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：黃漢菊20090501華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文3HeLa細(xì)胞干預(yù)的影響。同時(shí)觀察其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)PCNA的作用，為RNA干擾技術(shù)對(duì)腫瘤的基因治療提供了一定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目的目的在了解增殖細(xì)胞核抗原的分子生物學(xué)及免疫學(xué)特性的基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建PCNA的shRNA的真核表達(dá)載體并在

2、HeLa細(xì)胞表達(dá)，觀察PCNA的shRNA對(duì)人HeLa細(xì)胞體外增殖的影響及生物學(xué)特性的改變。同時(shí)利用shRNA質(zhì)粒介導(dǎo)抑制人HeLa細(xì)胞表達(dá)PCNA，觀察其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)裸鼠移植腫瘤生長(zhǎng)的影響。方法方法1.根據(jù)PCNA的cDNA的序列設(shè)計(jì)shRNA的引物，插入真核表達(dá)載體pGenesil1構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pGenesil1PCNA14，并通過(guò)酶切和測(cè)序等方法進(jìn)行鑒定，將真核表達(dá)質(zhì)粒pGenesil1PCNA14轉(zhuǎn)染人HeLa細(xì)胞，運(yùn)用集

3、落形成試驗(yàn)、單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)觀察PCNA的shRNA對(duì)人HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，免疫組化技術(shù)和westernblot檢測(cè)PCNA的蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化。2.裸鼠皮下注射HeLa細(xì)胞，待形成肉眼可見的皮下腫瘤后，隨機(jī)分組，分別于腫瘤組織周圍進(jìn)行注射。空白對(duì)照組注射生理鹽水；陰性對(duì)照組注射含無(wú)意義序列shRNA質(zhì)粒；PCNAshRNA組注射含PCNAshRNA質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000組。將穩(wěn)定表達(dá)P

4、CNAshRNA與表達(dá)無(wú)意義序列shRNA的HeLa細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞分別注射于裸鼠皮下，觀察腫瘤成瘤率以及腫瘤生長(zhǎng)情況。分別剝離各組移植腫瘤，測(cè)量腫瘤組織勻漿上清液測(cè)總蛋白含量及PCNA含量。結(jié)果結(jié)果1.通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PCNAshRNA，發(fā)現(xiàn)PCNA的shRNA能顯著抑制人HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞于G0G1—S期2.裸鼠腋部皮下分別注射未轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定表達(dá)PCNAshRNA和無(wú)意義序列shRNA的HeLa細(xì)胞后，