環(huán)氧合酶2高表達及siRNA沉默其基因對宮頸癌生物學行為的影響.pdf

1、一、未絕經宮頸癌患者腫瘤組織中環(huán)氧合酶2的表達及其意義
　　 目的：探討環(huán)氧合酶2(COX-2)在宮頸癌組織中的表達與月經周期的關系及其臨床意義。
　　 方法：選取47例未絕經宮頸癌手術病人，病史結合子宮內膜HE染色觀察判斷患者所處月經周期時段，采用免疫組織化學SABC法檢測宮頸癌組織中COX-2及增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，計算機圖像分析COX-2免疫染色密度值，計數PCNA標記指數(LI)。
　　 結果

2、：47例宮頸癌病人，增生期患者COX-2表達陽性率較分泌期無顯著性差異，但陽性患者表達強于分泌期。宮頸癌組織中COX-2表達水平與PCNA LI值呈顯著正相關性。有淋巴結轉移、局部肌層浸潤者COX-2表達陽性率高于無轉移者，宮頸癌組織中COX-2的表達與FIGO臨床分期、組織分化程度無顯著相關性。
　　 結論：未絕經宮頸癌患者腫瘤組織中COX-2的表達在增生期較分泌期明顯增強，并參與調節(jié)腫瘤的生長、轉移。
　　 二、雌、

3、孕激素對宮頸癌Hela細胞環(huán)氧合酶-2表達的影響
　　 目的：研究17-β雌二醇(E2)、甲羥孕酮(MPA)對Hela細胞腫瘤相關基因COX-2表達的影響。
　　 方法：將培養(yǎng)的Hela細胞分為對照組、無水乙醇組、E2組、E2＋MPA組和MPA組，分別用相應藥物處理24h，Western blot、RT-PCR方法檢測COX-2蛋白及mRNA表達變化，同時采用免疫細胞化學SABC法染色檢測COX-2，PCNA在Hela細

4、胞的表達，計算機圖像分析PCNA免疫染色平均光密度值。
　　 結果：正常培養(yǎng)的Hela細胞即有COX-2蛋白表達，E2可顯著上調其蛋白及mRNA表達，而MPA、MPA＋E2組 COX-2的蛋白及mRNA表達水平顯著下調。各組PCNA平均光密度值E2組平均光密度較對照組高，差異顯著，E2＋MPA組和MPA組顯著降低。
　　 結論：Hela細胞中COX-2的表達受女性激素的調控，E2上調其表達，MPA、E2＋MPA下調其表達

5、，并可能因此影響Hela細胞的增殖活性。
　　 三、COX-2 siRNA真核表達載體構建及其效應檢測
　　 目的：構建可在真核細胞表達COX-2 siRNA的真核表達載體，并檢測其對Hela細胞COX-2表達的抑制效應，為研究COX-2基因的功能提供前提條件。
　　 方法：選擇COX-2的全長基因序列作為分析序列，采用Ambion公司軟件和siRNA 設計原則，設計兩條特異的siRNA 靶序列，體外合成發(fā)卡狀s

6、iRNA序列，以亞克隆法經BamHI和HindIII酶切位點分別克隆入Pgenesil-1載體，即Pgenesil-C1、Pgenesil-C2，插入一段等長隨機序列的P-Control作為陰性對照。經PstI和SalI酶切鑒定和測序后，以脂質體法將其轉染至人宮頸癌Hela細胞系，轉染48h分別用RT-PCR和Western blot方法評價對COX-2表達的抑制效應。
　　 結果：酶切鑒定和測序結果證實發(fā)卡狀siRNA序列成功

7、連接到Pgenesil-1載體，轉染Pgenesil-C1、 Pgenesil-C2后48h，Hela細胞COX-2 mRNA和蛋白的表達水平顯著降低，效率分別達87％、53％。
　　 結論：成功構建了針對COX-2基因的siRNA真核表達載體，Pgenesil-C1可以有效抑制COX-2基因的表達。
　　 四、RNAi沉默環(huán)氧合酶-2基因對宮頸癌Hela細胞細胞周期影響及其機制的實驗研究
　　 目的：利用RNA

8、干擾(RNAi)抑制宮頸癌Hela細胞COX-2表達研究其對細胞周期的影響及其機制。
　　 方法：以脂質體法將COX-2小干擾RNA(siRNA)真核表達載體質粒Pgenesil-C1轉染至Hela細胞系，對照質粒P-Control作為對照組。分別用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞的增殖活性，流式細胞技術檢測Hela細胞細胞周期改變，用Western blot方法檢測cyclinD1及cyclinE蛋白的表達變化。
　　

9、 結果：轉染Pgenesil-C1后細胞增殖活性受到顯著抑制，流式細胞儀分析結果顯示轉染Pgenesil-C1后Hela細胞G0/G1期細胞較對照組顯著增多，而S期和G2/M細胞較對照組顯著減少，同時cyclinD1及cyclin E蛋白表達顯著降低，轉染后96h凋亡細胞較對照組增多，凋亡率為3.25％。
　　 結論：利用RNAi技術抑制COX-2表達可以降低Hela細胞增殖活性，可能通過下調cyclinD1及cyclin E

10、的表達使細胞周期阻滯于G0/G1期。
　　 五、COX-2基因表達下調對宮頸癌Hela細胞順鉑化療敏感性的影響及其機制研究
　　 目的：利用RNA干擾(RNAi)抑制Hela細胞COX-2表達后凋亡相關基因表達的變化，研究COX-2對Hela細胞順鉑(CDDP)化療敏感性影響及其作用機制。
　　 方法：構建特異性COX-2小干擾RNA(siRNA)真核表達載體質粒Pgenesil-C1，以脂質體法將其轉染至Hel

11、a細胞系，隨機序列質粒P-Control作為對照組，G418篩選陽性克隆，用不同濃度CDDP作用于各組Hela細胞12h，用MTT檢測Hela細胞的存活率，流式細胞技術檢測Hela細胞凋亡率的變化。用RT-PCR方法檢測Survivin、Bax和Bcl-2 mRNA的表達變化。
　　 結果：MTT結果顯示Hela細胞存活率隨CDDP濃度升高而降低，Pgenesil-C1組較對照組降低更為顯著，流式細胞儀分析顯示轉染Pgenesi