環(huán)氧合酶COx-2與食管鱗癌生物學(xué)行為的臨床研究.pdf

1、本課題應(yīng)用免疫組化法以及Western blot等技術(shù)檢測環(huán)氧合酶COX-2在食管鱗狀細胞癌組織以及正常食管粘膜組織中的表達情況，并結(jié)合入組患者的臨床病理資料及完整的隨訪資料，意在探討COX-2表達高低與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系，以資證明是否可將COX-2表達高低作為判斷食管鱗癌患者預(yù)后的可靠指標。與此同時，我們嘗試通過RNA沉默技術(shù)，阻斷食管鱗癌Eca109細胞系COX-2的表達，檢測COX-2表達被抑制前后食管鱗癌細胞的增殖與侵襲能力

2、，以求明確COX-2與食管鱗癌細胞生物學(xué)行為之間的關(guān)系，以此為理論基礎(chǔ)，進一步探討COX-2作為食管鱗癌靶向治療靶點的可能性。
　　第一部分 COX-2在食管鱗癌組織中的表達及其與食管鱗癌患者臨床特征之間的相關(guān)性研究
　　目的：
　　1.檢測食管鱗狀細胞癌組織和正常食管粘膜組織中COX-2的表達情況
　　2.統(tǒng)計分析COX-2的表達情況與食管鱗狀細胞癌患者臨床病理學(xué)特點之間的關(guān)系
　　方法：
　　本實

3、驗入組患者共118例，均為在2006年10月～2009年9月間在山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院胸外科接受外科手術(shù)的胸中段食管癌患者。實驗中，成對留取患者的病理標本，包括食管鱗狀細胞癌組織和癌旁正常食管粘膜組織。本組病例無手術(shù)前放/化療者。手術(shù)方式為經(jīng)右胸和上腹部二切口食管癌切除、胃食管右胸頂吻合術(shù)（Ivor-Lewis手術(shù)）。應(yīng)用免疫組化法和Western blot法檢測每份標本中COX-2的表達情況，同時結(jié)合所有入組患者的臨床病理學(xué)資料進行

4、回顧性分析。應(yīng)用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。其中，運用均數(shù)±標準差(x±s)的方式來表示計量資料，進行兩組均數(shù)的比較時，若方差齊，則運用獨立樣本t檢驗，若方差不齊，則運用t'檢驗。應(yīng)用卡方檢驗分析COX-2的表達情況與入組患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。P＜0.05時，認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　在免疫組化法中，細胞漿或細胞膜被染成棕色或黃色顆粒被認為是COX-2表達陽性。在入組的所有患者的食管鱗狀細胞癌標本中

5、，有88例(74.6％)入組患者的食管鱗癌標本中可發(fā)現(xiàn)COX-2表達陽性?？ǚ綑z驗證實，癌旁正常的食管黏膜組織中的COX-2的表達水平明顯低于癌組織中COX-2的表達水平(P＜0.001)。
　　118例患者腫瘤組織中Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期患者COX-2陽性表達率分別為54.3％和83.1％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=10.805，P=0.001);T1、T2和T3+T4患者COX-2陽性表達率分別為50.0％、60.0％和82.5％，

6、COX-2表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=8.559，P=0.014)。有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者COX-2表達率分別為80.7％和56.7％，兩組COX-2表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=6.805，P=0.009)。Western blot檢測結(jié)果顯示，COX-2的表達水平與腫瘤浸潤深度（T分期）呈明顯正相關(guān)(P＜0.05)。通過卡方檢驗可以看出，COX-2表達情況與病變浸潤深度(P=0.014)、病變分化程度(P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情

7、況(P=0.009)及pTNM分期(P=0.001)顯著相關(guān)，而與年齡、性別等其他臨床病理學(xué)特點并無明顯相關(guān)性。簡單的說，腫瘤分化程度越差，浸潤深度越深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多，pTNM分期越晚，則COX-2陽性表達率越高。在本實驗中，66例pT3+T4期患者食管鱗狀細胞癌標本中可檢測到COX-2陽性表達;43例(89.5％)低分化的食管鱗狀細胞癌患者標本中可檢測到COX-2陽性表達;，69例(83.1％)術(shù)后病理分期為Ⅲ期和Ⅳ期的患者的食管鱗

8、狀細胞癌標本中可檢測到COX-2陽性表達。
　　結(jié)論:
　　1.在食管鱗狀細胞癌組織中，COX-2表達顯著增高。
　　2.COX-2的高表達與食管鱗狀細胞癌病變浸潤深度、病變分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及其pTNM分期呈顯著正相關(guān)。
　　3.COX-2的高表達與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移潛在相關(guān)。
　　第二部分 COX-2與食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析
　　目的:
　　探究COX-2

9、的表達與經(jīng)手術(shù)完整切除的胸中段食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。
　　方法:
　　本實驗入組患者共118例，均為在2006年10月～2009年9月間在山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院胸外科接受外科手術(shù)的胸中段食管癌患者。通過免疫組化法檢測上述患者食管鱗狀細胞癌組織中COX-2的表達情況，并結(jié)合完整的隨訪資料，建立數(shù)據(jù)庫。通過SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，運用Kaplan-Meier法及Cox多因素回歸分析計算患者生存率并檢測影響

10、生存率的預(yù)后因素。當P值＜0.05時，認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　有、無COX-2表達患者的5年生存率為10.22％和50.0％，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。T2患者中，有、無COX-2表達者5年生存率分別為16.7％和66.7％，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005);T3+T4患者中，有、無COX-2表達組的5年生存率分別為4.5％和21.4％，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029)。pN0患者中，有

11、、無COX-2表達患者5年生存率分別為47.1％和92.3％，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009);pN1+N2患者中，有、無COX-2表達組5年生存率分別為1.4％和17.6％，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。本實驗中ESCC患者總體的3年生存率是36.4％，5年生存率20.3％。中位生存時間是33.0個月（95％可信區(qū)間:28.6-49.4個月）。ESCC組織中未查到COX-2高表達的患者，其3年和5年生存率分別是73.3

12、％和50％;而ESCC組織中有COX-2高表達的患者，其3年和5年生存率分別是23.9％和10.2％，中位生存時間為22.0個月（95％可信區(qū)間:18.9-32.1個月）。單因素分析表明，COX-2表達水平的高低是ESCC患者至關(guān)重要的預(yù)后因素(P=0.004)。ESCC組織中有無COX-2的高表達，其5年生存率有明顯差異，統(tǒng)計分析顯示結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　通過單因素分析，我們發(fā)現(xiàn)預(yù)后因素還包括腫瘤分化程度和pTNM分期。分化

13、程度越低，則5年生存率越差，低分化的ESCC患者，5年生存率僅為2.1％，與此同時，高、中分化ESCC患者的5年生存率則為32.9％，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。pTNM分期越晚，則患者5年生存率越低。Ⅰ+Ⅱ期患者5年生存率為60.0％，而Ⅲ+Ⅳ期患者5年生存率則降至1.2％，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。同時，分析結(jié)果還顯示，年齡(Age)、性別(Gender)等因素與患者術(shù)后5年生存率并無顯著關(guān)聯(lián)。
　

14、　通過COX多因素回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)，腫瘤分化程度(P=0.001)、TNM分期(P=0.001)和COX-2表達水平(P=0.004)均是判斷胸中段食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后的獨立危險因素。
　　結(jié)論:
　　1.腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、pTNM分期及COX-2表達水平與ESCC患者術(shù)后5年生存率有明顯關(guān)聯(lián)。
　　2.COX-2表達水平是ESCC患者術(shù)后5年生存率的獨立危險因素。
　　3.COX-2高表達的胸中段

15、食管鱗癌患者預(yù)后不良，提示COX-2有成為預(yù)測食管鱗癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的潛在基因的可能。
　　第三部分 COX-2 s iRNA體外阻斷COX-2表達對食管鱗癌Eca109細胞生物學(xué)行為影響的研究
　　目的:
　　通過RNA沉默技術(shù)，以COX-2siRNA體外阻斷食管鱗癌Eca109細胞系COX-2的表達，檢測COX-2表達被抑制前后食管鱗癌細胞的增殖與侵襲能力的差異。
　　方法:
　　具體步驟如下:

16、>　　1.應(yīng)用RT-PCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測食管鱗癌Eca109細胞系中COX-2的表達情況。
　　2.通過慢病毒攜帶COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌Eca109細胞系，抑制COX-2的表達，構(gòu)建穩(wěn)定的經(jīng)RT-PCR和Western blot檢驗抑制COX-2表達的Eca109細胞系。
　　3.應(yīng)用MTT法比較COX-2表達被抑制前后Eca109細胞的增殖情況。
　　4.通過Tra

17、nswell侵襲實驗比較COX-2表達被抑制前后Eca109細胞的侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)驗證，食管鱗癌細胞系中存在COX-2高表達。
　　2.本實驗中，我們應(yīng)用慢病毒攜帶COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌Eca109細胞系，成功構(gòu)建了經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測COX-2穩(wěn)定低表達的Eca109細胞系。
　　3.實驗結(jié)果顯示，COX-2表達被抑制的食管鱗癌細胞的增殖和侵襲能力受到明顯抑