LSD1在食管鱗癌中表達及對腫瘤部分生物學行為的影響.pdf

1、研究背景
　　組蛋白共價修飾是一種重要的表觀遺傳模式，包括組蛋白乙?；?、甲基化、磷酸化以及泛素化等，其中乙?；c甲基化是目前研究比較多的組蛋白修飾方式。2004年Shi等人的研究組發(fā)現賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶(Lysine specific demethylase1，LSD1)，打破了以往認為組蛋白甲基化不可逆的觀點。
　　在LSD1催化去甲基化反應的過程中，不同的分子伴侶可以介導LSD1作用于不同的底物，從而產生不同的

2、生物學效應。LSD1通過阻遏元素沉默轉錄因子輔阻遏物(Co-repressor of the repressor element silencing transcription factor，CoREST)復合體與靶基因結合時，可以使組蛋白H3上第4位賴氨酸(Lysine，K) H3K4去甲基化，該過程與染色質濃縮及轉錄抑制有關，此時LSD1作為轉錄抑制因子抑制基因的表達。LSD1與雄激素受體(Androgen Receptor，AR)

3、或者雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)結合后，可以特異性的催化組蛋白H3上第位賴氨酸(H3K9)的去甲基化。H3K9的去甲基化與染色質的開放構象和基因表達相關，此時AR/ER依賴的基因表達上調，LSD1促進轉錄激活。
　　近年來多項功能研究發(fā)現LSD1通過調節(jié)靶基因的表達，在腫瘤的發(fā)生、胚胎分化、異染色質的形成、細胞內DNA甲基化狀態(tài)的合理維持以及誘導多能干細胞(inducedpluripotent stem

4、cell，iPS cell)形成等多方面起到重要作用。前期相關研究發(fā)現在前列腺癌、乳腺癌以及血液系統(tǒng)腫瘤等方面，普遍發(fā)現LSD1的高表達，通過敲除LSD1或抑制LSD1作用后，可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖。另外，目前已經有多種組蛋白修飾酶抑制劑用于腫瘤的治療，如組蛋白去乙?；敢种苿?Inhibitors of histone deacetylases，HDACi)，而LSD1抑制劑也有望成為抗腫瘤藥物開發(fā)的新靶點。深刻認識并揭示LSD1

5、的作用機制和組蛋白甲基化與去甲基化動態(tài)平衡機制，對于腫瘤防治藥物的開發(fā)具有重要意義。
　　食管癌是世界第八大腫瘤，其發(fā)生具有明顯的地域性，亞洲地區(qū)是食管癌高發(fā)區(qū)之一。早期食管癌患者手術治療后5年生存率高，隨著食管癌的進展，中晚期食管癌患者預后不良，尤其是伴有轉移的患者。同時由于食管癌的早期檢出率偏低，嚴重影響了該病的治療效果。前期研究發(fā)現，如同其他大部分惡性腫瘤一樣，食管癌的發(fā)生和發(fā)展經歷了遺傳物質及表觀遺傳修飾的雙重突變，而表觀

6、遺傳修飾的可逆性也昭示著食管癌預防和有效治療的可能性。LSD1在食管癌中的表達和作用機制目前仍不明確，本研究試闡明LSD1在食管癌的發(fā)生和發(fā)展中可能起到的作用，為食管癌發(fā)生發(fā)展機制的深入探討以及臨床診斷和治療奠定初步基礎。
　　研究目的
　　本研究通過對食管癌組織及其組織芯片，食管癌癌前病變以及正常食管黏膜中LSD1表達情況的研究，揭示LSD1表達量與食管癌惡性程度、浸潤深度、轉移等生物學性質的關系，推測LSD1的表達與食管

7、癌患者預后的可能關聯(lián)。同時通過檢測及干預食管癌細胞株內LSD1的表達和作用，觀察細胞的增殖、凋亡、浸潤以及轉移能力變化，進一步探討LSD1在食管癌發(fā)生和發(fā)展中起到的可能作用，從而為食管癌的預防和治療提供新的方案。
　　研究方法
　　一、組織標本實驗:探討LSD1在不同臨床組織標本中的表達及意義
　　實驗分組:正常食管黏膜組織、食管癌癌前病變組織（上皮內瘤變及不典型增生等）及其人食管鱗癌組織三組。
　　實驗步驟:制

8、作組織蠟塊及組織芯片，HE染色明確臨床診斷。免疫組化染色，檢測上述組織中LSD1和腫瘤增殖抗原Ki67的表達情況，TUNEL檢測食管癌組織芯片中細胞凋亡情況，由兩位病理醫(yī)師根據免疫反應積分打分法(Immnohistochemicalsemi-quantitative Remmele scoring system，IRS)對染色結果分別進行評分，即:免疫組化染色的評分同時考慮免疫反應染色強度(staining intensity，SI)和

9、陽性細胞百分比(positive percent，PP)。SI分值:0分為未見陽性細胞，1分為細胞陽性染色最強處呈現弱陽性，2分為陽性，3分為可見強陽性染色的細胞;PP分為5級:0分為無染色陽性區(qū)域，1分為陽性染色區(qū)域≤10％，2分為陽性區(qū)域介于11％～50％，3分51％～80％，當陽性染色區(qū)域＞80％時為4分。IHC得分=SI×PP。最后按得分將結果區(qū)分為陰性表達、高表達與低表達三組:陰性即最終積分為0，低表達即0＜積分≤4分，評分＞

10、4分為高表達。
　　經過對食管鱗癌患者術后的隨訪，獲取患者基本資料、相關臨床治療方案及預后信息。分析LSD1表達量與食管癌患者病例資料及預后信息的關系，探討LSD1表達與細胞增殖及凋亡的關系。
　　二、細胞實驗:探討LSD1表達對食管癌細胞株部分生物學行為的影響
　　實驗分組:根據食管癌細胞株的不同，分為KYSE150、KYSE450以及EC109三組。
　　實驗步驟:使用Western Blot及RT-PCR檢

11、測LSD1在不同食管癌細胞株內的蛋白和RNA表達水平。Transwell及劃痕實驗檢測食管癌細胞株在不同LSD1表達水平時的侵襲及運動能力。
　　三、干擾實驗:敲除LSD1的表達或抑制LSD1的作用，觀察食管癌細胞株生物學行為的改變
　　1.慢病毒穩(wěn)定敲除食管癌細胞株KYSE450中LSD1的表達，根據敲除程度的不同分為兩組，同時轉染無敲除能力的慢病毒作為對照組。以綠色熒光蛋白(GFP)的穩(wěn)定表達作為慢病毒轉染成功的標志。<

12、br>　　實驗分組:慢病毒敲除組1(KD1)，慢病毒敲除組2(KD2)以及空載慢病毒轉染的對照組（Negative Control）。
　　實驗步驟:構建慢病毒敲除食管癌細胞株內LSD1的表達并用Western Blot及RT-PCR的方法進行驗證。檢測食管癌細胞株經LSD1敲除后，侵襲及運動能力的改變。分析細胞生物學行為的改變與LSD1表達的關系。
　　2.LSD1抑制劑tranylcypromine以不同濃度作用于食管癌

13、細胞株KYSE450，抑制LSD1的去甲基化作用，檢測細胞株內蛋白表達并觀察細胞株生物行為的改變。
　　實驗分組:根據LSD1抑制劑濃度的不同進行分組，最終作用濃度:0uM（對照），50uM以及250uM。
　　實驗步驟:以tranylcypromine不同濃度作用于KYSE450細胞株，培養(yǎng)24h后提取細胞株蛋白。以WB的方法檢測細胞內LSD1、H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1以及K3K9me2的表達，確定L

14、SD1在食管癌細胞株KYSE450內可能的作用位點。同時，采用劃痕實驗、Transwell實驗等檢測抑制劑不同作用濃度時，細胞侵襲和運動能力的變化。
　　研究結果
　　1.獲取正常食管組織29例，食管癌癌前病變組織23例及食管癌組織134例。免疫組化檢測LSD1情況，發(fā)現LSD1在51.7％的正常上皮組織基底部有少量表達;在癌前病變組織內表達陽性率為73.9％，也均為低表達;腫瘤組織中表達陽性率為75.4％，其中43.7％的

15、組織內LSD1表達為強陽性。腫瘤組織中LSD1表達明顯強于正常組織(p＜0.01)及處于癌前病變期的食管黏膜組織(p＜0.01)。
　　2.LSD1表達與患者的性別、年齡等基本臨床資料無相關性，與腫瘤的生長類型、分化程度以及浸潤深度等病理資料也無明顯相關。但LSD1表達高低與食管癌的淋巴結轉移有關(p＜0.05)，且明顯影響患者的生存期，LSD1高表達的患者預后明顯差于LSD1低表達組(p＜0.01)。
　　3.LSD1表達

16、與Ki67均表達在增殖能力比較強的正常食管上皮基底部，且在食管癌組織中LSD1的表達與Ki67具有顯著相關性(p＜0.01)，LSD1高表達時Ki67的表達也明顯增多。LSD1表達與食管癌腫瘤細胞凋亡無顯著相關性，在食管癌組織切片中凋亡細胞很少，無論LSD1表達高或者低。
　　4.食管癌細胞株KYSE450，KYSE150及EC109內，LSD1表達量不同，其中KYSE450及KYSE150細胞株內LSD1表達水平明顯高于EC10

17、9細胞(p＜0.01)。
　　5.劃痕實驗及Transwell實驗證實KYSE450及KYSE150細胞的運動能力和侵襲能力均較EC109細胞強(p＜0.01)。
　　6.慢病毒轉染敲除KSE450細胞內LSD1的表達后，得到兩株敲除水平不同的KYSE450細胞，與對照細胞比，敲除LSD1的KYSE450細胞運動和侵襲能力明顯降低，且與LSD1表達水平有關。
　　7.LSD1抑制劑tranylcypromine作用于K

18、YSE450細胞后，細胞內H3K4me1表達量隨作用濃度增高而降低，H3K4me2隨作用濃度增高而增高，H3K9甲基化水平未出現明顯變化。
　　8.Tranylcypromine可以明顯抑制KYSE450細胞的運動和侵襲能力，且抑制強度隨藥物作用濃度的升高而增加。
　　研究結論
　　1.LSD1在食管癌中表達明顯高于正常食管組織及食管癌癌前病變組織，且LSD1的表達增多與食管癌患者的淋巴結轉移相關，并能影響患者預后。L

19、SD1表達增多與Ki67表達增多正相關，可能與食管癌的增殖能力有關，但與食管癌細胞凋亡無關。
　　2.不同食管癌細胞株表達LSD1的水平不同，其中侵襲和運動能力較強的KYSE450和KYS150細胞株中LSD1表達較高。
　　3.慢病毒敲除KYSE450中LSD1的表達后，細胞運動和侵襲能力明顯下降。LSD1抑制劑Tranylcypromine處理KYSE450細胞，可以明顯抑制細胞的侵襲和轉移，同時發(fā)現H3K4的甲基化狀態(tài)