PLCE1對食管鱗癌生物學行為的影響及相關miRNAs調(diào)控機制初步研究.pdf

1、第一部分 PLCE1表達對食管鱗癌細胞生物學行為的影響
　　目的：探討PLCE1蛋白在不同食管病變組織中的表達及臨床意義；觀察PLCE1基因?qū)κ彻荀[癌細胞株生物學功能學的影響；初步研究 PLCE1基因在食管鱗癌中可能調(diào)控的下游分子和信號通路。
　　方法：（1）收集石蠟包埋的112例新疆漢族食管鱗癌組織、99例食管鱗癌癌前病變組織（低級別上皮瘤變60例，高級別上皮內(nèi)瘤變39例）和99例癌旁正常組織，制備組織芯片，應用免疫組化檢

2、測 PLCE1蛋白的表達并分析其與食管鱗癌臨床病理特征及與食管鱗癌患者預后的關系；（2）檢索PubMed，MEDLINE，EMBASE，Web of science，維普，CNKI數(shù)據(jù)庫，收集從建庫至2014年8月期間關于PLCE1蛋白表達與食管鱗癌相關性的文獻，將符合入選標準的文獻按研究方法歸類整理原始數(shù)據(jù)匯總后進行Meta分析和統(tǒng)計處理，分析評價PLCE1蛋白與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的相關性。（3）用PLCE1特異性的siRNA轉(zhuǎn)

3、染食管鱗癌細胞系，運用MTT法檢測細胞生長情況，流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化，檢測不同處理對凋亡和增殖相關蛋白的表達影響；利用transwell小室侵襲實驗檢測不同處理下食管鱗癌細胞的侵襲和遷移能力及對上皮間葉轉(zhuǎn)化相關標記物的表達影響，應用免疫熒光檢測不同處理組細胞的形態(tài)和骨架蛋白F-actin的表達變化情況；應用MTT法、流式細胞儀觀察并檢測TNF-α、TRAIL、Paclitaxel、5-FU對沉默PLCE1基因后的食管鱗癌細胞的細

4、胞增殖抑制及凋亡的變化。（4）應用人類表達譜芯片Affymetrix3’IVT對不同處理組細胞進行基因芯片分析，篩選出差異表達基因，并利用生物信息學進行GO分析和KEGG、PATHWAY分析。
　　結(jié)果：（1）PLCE1蛋白的表達主要位于食管鱗癌細胞的胞漿，正常組織、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、食管鱗癌組織中 PLCE1蛋白的高表達率分別為2.03％（2/99）、58.33%（35/60）、72.50%（28/39）和73

5、.22%（82/112），PLCE1蛋白在癌組織中的表達明顯高于正常組織（免疫組化評分：6.768±0.2717 vs1.707±0.1416，P<0.001），高級別上皮內(nèi)瘤變組織中的表達明顯高于正常組織(免疫組化評分：7.103±0.4312 vs1.707±0.1416,P<0.001），低級別上皮內(nèi)瘤變組織中的表達明顯高于癌旁正常組織（免疫組化評分：6.333±0.3808 vs1.707±0.1416,P<0.001），鱗癌組

6、織中的表達明顯高于低級別上皮內(nèi)瘤變組織（免疫組化評分：6.768±0.2717 vs6.333±0.3808,P=0.046）。（2）PLCE1蛋白表達與食管鱗癌發(fā)病性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化及浸潤深度等臨床病理特征沒有統(tǒng)計學意義（P=0.253,0.309,0.787,0.542,0.418,0.467），但其高表達與臨床TNM分期（P=0.024）及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移（P=0.021）密切相關。Kaplan-Meier生存分析發(fā)

7、現(xiàn) PLCE1蛋白高表達與食管鱗癌患者生存時間明顯低于低表達患者（log-rank test,χ2=10.243,P=0.001）。用Cox回歸模型進行食管鱗癌預后因素篩選發(fā)現(xiàn)，在包括年齡、性別、吸煙、腫瘤大小、組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的多因素分析中，PLCE1蛋白的表達（HR：8.435，95%CI=1.875-37.983，P=0.005）可以作為獨立因素影響食管鱗癌患者的預后因素。（3）在meta分析PLCE1表達

8、與ESCC臨床病理關系的研究中，共納入4篇參考文獻（總計388例食管鱗癌患者，117例正常對照），結(jié)果顯示PLCE1表達與腫瘤的進展有密切關系（pooled OR=5.93;95%CI=3.86-9.11），而與腫瘤的浸潤深度（pooled OR=1.54;95%CI=0.84 to2.82）、分化（pooled OR=1.55;95%CI=0.71-3.36）和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移（pooled OR=2.83;95%CI=0.89-9.06

9、）無明顯關聯(lián)（P＞0.05）。（4）轉(zhuǎn)染入PLCE1 siRNA質(zhì)粒后，MTT和單克隆形成實驗顯示食管鱗癌細胞的生長受到明顯抑制、食管鱗癌細胞株的細胞團數(shù)明顯減少，流式細胞實驗顯示經(jīng)過PLCE1siRNA轉(zhuǎn)染的食管鱗癌細胞株與對照組相比，早期和晚期凋亡的比率明顯升高（P<0.05），食管鱗癌細胞株中凋亡相關蛋白Bax和cleaved-PARP的表達量明顯增高。Transwell實驗顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染PLCE1 siRNA質(zhì)粒的食管鱗癌細胞株的形

10、態(tài)由原來的長梭形變?yōu)闄E圓形，其侵襲和遷移能力明顯降低；PLCE1基因被干擾后，其上皮的標記物E-cadherin明顯升高，而間葉的標記物Vimentin則明顯下降。免疫熒光實驗報告顯示干擾PLCE1表達后，細胞骨架蛋白F-actin的表達明顯降低。（5）PLCE1基因被干擾后，食管鱗癌細胞經(jīng)TNF-α、TRAIL、Paclitaxel、5-FU處理后，其細胞數(shù)量明顯減少，凋亡比例明顯增高?？梢?，PLCE1可增加食管鱗癌細胞對TNF-α、

11、TRAIL、Paclitaxel和5-FU藥物的抵抗。（6）利用表達譜芯片篩選轉(zhuǎn)染 PLCE1siRNA人食管鱗癌細胞前后的差異表達基因223個，其中上調(diào)基因168個，下調(diào)基因55個，這些基因主要涉及細胞增殖、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導、蛋白酶活性、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等方面，涉及的通路有 MAPK通路，粘著斑形成，Axon guidance，p53通路，Starch and sucrose metabolism，ECM-receptor inte

12、raction，Toll樣受體信號通路，D-Glutamine and D-glutamate metabolism，Cytokine-cytokine receptor interaction，Glutamate metabolism等。
　　結(jié)論：（1）PLCE1在食管鱗癌及癌前病變組織中的表達明顯高于正常組織的表達，其高表達與食管鱗癌患者預后差密切相關且是影響食管鱗癌患者預后的獨立因素；（2）PLCE1不但可促進食管鱗癌細胞

13、的增殖并抑制其凋亡，還可以增強食管鱗癌細胞對細胞因子和化療藥物的耐藥性，且其可以通過影響骨架蛋白表達及上皮間葉轉(zhuǎn)化來調(diào)控食管鱗癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　目的：（1）闡明miR-145靶向調(diào)控PLCE1表達對食管鱗癌細胞生物學特性的影響；（2）篩選并探討PLCE1在食管鱗癌中可以調(diào)控的miRNA及其下游靶基因在食管鱗癌發(fā)生中的作用機制。
　　方法：（1）運用生物信息學預測可能靶向調(diào)控PLCE1的miRNAs，應用熒光素酶報告實驗

14、驗證PLCE1是miR-145的靶基因，觀察miR-145通過調(diào)控PLCE1對食管鱗癌細胞生物學行為的影響，應用實時定量PCR檢測食管鱗癌組織及其正常食管組織中miR-145和PLCE1的表達情況，分析它們之間的相關性。（2）運用Affymetrix
　　GeneChip? miRNA3.0 Arrays芯片來篩選PLCE1基因可能調(diào)控的下游miRNAs分子并進行驗證。（3）對驗證得出的miR-106b分子在食管鱗癌細胞中進行生物

15、功能學的研究；應用熒光素酶報告實驗驗證RBL1和RBL2是miR-106b的靶基因；觀察PLCE1通過調(diào)控miR-106b以及靶基因進而對食管鱗癌細胞生物學行為的影響。（4）應用實時定量PCR檢測食管鱗癌組織和正常食管組織中miR-106b的表達，應用免疫組化檢測368例食管鱗癌組織和215例正常食管組織中RBL2蛋白的表達情況，并聯(lián)合分析PLCE1蛋白、miR-106b和RBL2蛋白表達的相關性。
　　結(jié)果：（1）運用生物信息學

16、軟件進行對可能靶向調(diào)控PLCE1基因的miRNAs進行預測，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)miR-145為三個軟件共同預測的分子。通過在食管鱗癌細胞系中檢測兩者的表達情況，初步確認PLCE1與miR-145可能存在一定的負向調(diào)控關系。通過轉(zhuǎn)染miR-145mimcs和inhibitor對PLCE1表達的調(diào)控作用以及應用熒光素酶報告實驗，發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌細胞系中miR-145可靶向調(diào)控PLCE1的表達。（2）miR-145可顯著抑制食管鱗癌細胞的增殖，促進食

17、管鱗癌細胞的凋亡，并可通過調(diào)控細胞的骨架從而抑制食管鱗癌細胞的遷移能力，增強miR-145表達且轉(zhuǎn)染PLCE1 siRNA介導的PLCE1基因沉默能更加顯著的降低食管鱗癌的增殖和侵襲能力。（3）與癌旁正常食管組織相比，miR-145在癌組織中表達顯著降低（癌組織41.92±9.089，正常組織104.4±13.00，P=0.0002），miR-145的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0：66.54±32.47，N1-3：25.89±9.95，P=0

18、.0002）和臨床分期密切相關（T1/2：54.01±21.86，T3/4：31.03±15.77，P=0.0381）。食管鱗癌組織樣本中miR-145 mRNA表達與PLCE1蛋白存在著明顯的負相關關系（r=-0.472，P=0.008）。（4）運用Affymetrix GeneChip? miRNA3.0 Arrays芯片檢測PLCE1可能調(diào)控的miRNAs分子，我們發(fā)現(xiàn)miR-106b-5p和miR-93可被PLCE1顯著上調(diào)。通

19、過實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)在沉默PLCE1后，miR-106b和miR-93表達顯著下調(diào)，初步在食管鱗癌細胞中確認PLCE1與miR-106b和miR-93存在顯著的正向調(diào)控關系。（5）miR-106b可顯著促進食管鱗癌細胞的增殖和遷移，抑制食管鱗癌細胞的凋亡。初步驗證得出RBL2和RBL1為miR-106b的靶基因。增強miR-106b表達可部分逆轉(zhuǎn)siRNA介導的PLCE1基因沉默導致的食管鱗癌細胞增殖和侵襲能力降低，并且也部分逆轉(zhuǎn)P

20、LCE1基因沉默導致的食管鱗癌細胞凋亡增加。（6）與正常食管組織相比，miR-106b-5p在癌組織中表達顯著增高（P=0.0211），RBL2在癌組織中表達顯著降低（P<0.0001）。食管鱗癌組織樣本中PLCE1蛋白表達與miR-106b表達之間存在正相關關系（R=0.4814，P=0.0431），食管鱗癌組織樣本中PLCE1蛋白表達與RBL2蛋白表達之間存在負相關關系（R=-0.2934，P=0.0015），食管鱗癌組織樣本中mi