CypA對(duì)胰腺癌生物學(xué)行為的及影響的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　HIF-1與胰腺癌生物學(xué)行為密切相關(guān)。前期研究結(jié)果提示HIF-1α與CypA的表達(dá)存在相關(guān)性，二者之間可能存在調(diào)控關(guān)系。本研究旨在探討HIF-1與CypA的調(diào)控關(guān)系；CypA對(duì)胰腺癌生物學(xué)行為的影響及機(jī)制；CypA與HIF在胰腺癌病理組織中表達(dá)的相關(guān)性及CypA表達(dá)對(duì)胰腺癌病人預(yù)后的影響。
　　方法：
　　第一部分：HIF-1α與CypA的關(guān)系用Si-RNA-HIF-1α干擾胰腺癌細(xì)胞株BXPC-3 HIF

2、-1α表達(dá)、pc-DNA3.0-HIF-1α或低氧培養(yǎng)使MIA-paca-2細(xì)胞過(guò)表達(dá)HIF-1α。采用染色體免疫共沉淀技術(shù)確定HIF-1α與CypA啟動(dòng)子結(jié)合方式，定量PCR，western blot驗(yàn)證CypA與HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)，觀察抑制或過(guò)表達(dá)HIF-1α后CypA的表達(dá)。
　　第二部分：CypA對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響及機(jī)制用Si-RNA-HIF-1α轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株BXPC-3抑制HIF-1α、CypA

3、的表達(dá)；pc-DNA3.0-HIF-1α轉(zhuǎn)染MIA-paca-2細(xì)胞過(guò)表達(dá)HIF-1α，并通過(guò)給予抑制劑(2ME，CsA)抑制HIF-1α及CypA的表達(dá)，采用劃痕試驗(yàn)、Transwell小室法觀察對(duì)比兩種情況下細(xì)胞遷移能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期改變及凋亡情況；MTT檢測(cè)兩種情況下細(xì)胞增殖能力變化；PCR、Western blot、免疫熒光方法對(duì)比兩種情況下細(xì)胞HIF-1α，CypA，NFKB，ERK1/2，P-ERK1/2，P53的

4、表達(dá)。
　　第三部分：體內(nèi)驗(yàn)證HIF-1α及CypA信號(hào)通路對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響選取BALB/c裸鼠，制成胰腺癌皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為4組，對(duì)照組：3只，飼喂生理鹽水；2ME組：4只，飼喂2ME(2-methoxyestradiol，2ME，二甲氧雌二醇)；CsA組：4只，飼喂CsA(CyclosporinA，CsA，環(huán)孢霉素A)；2ME+CsA組：5只，飼喂2ME+CsA。待腫瘤生長(zhǎng)至5mm，每周2次給藥，連續(xù)2周，間隔1周為1周

5、期，共行3周期。給藥結(jié)束后處死試驗(yàn)動(dòng)物并完整獲取腫瘤組織、肝、腎組織，測(cè)量腫瘤大小及重量，免疫組化，檢測(cè)各組HIF-1α、CypA、NFkB、ERK1/2、P53的表達(dá)。
　　第四部分：HIF-1α與CypA在胰腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)相關(guān)性及CypA對(duì)患者預(yù)后的影響取胰腺癌病人根治術(shù)后的組織標(biāo)本79例，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)HIF-1α、CypA的表達(dá)：Spearman法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)患者進(jìn)行隨訪，Kaplan-Merier法繪

6、制生存曲線，行生存分析。
　　結(jié)果：
　　第一部分：HIF-1α與CypA的關(guān)系染色體免疫共沉淀技術(shù)顯示：HIF-1α與CypA啟動(dòng)子前-77bp處的第二位HRE相結(jié)合，而不能結(jié)合第一位和第三位HRE。定量PCR：BXPC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染Si-RNA，干擾HIF-1α后，HIF-1αmRNA的表達(dá)下降，CypA的mRNA表達(dá)也下降；MIA-paca-2細(xì)胞系過(guò)表達(dá)HIF-1α后，HIF-1α與CypA的mRNA表達(dá)均升高，干擾C

7、ypA的表達(dá)后HIF-1α表達(dá)升高。MIA-paca-2細(xì)胞低氧培養(yǎng)(1％O2)，1h及3h時(shí)間點(diǎn)HIF-1α與CypA mRNA的表達(dá)均升高，p<0.05。Western blot：與MIA-paca-2細(xì)胞相比HIF-1α在BXPC-3細(xì)胞中呈高表達(dá)，CypA蛋白在BXPC-3中的表達(dá)高于MIA-paca-2細(xì)胞，二者比值為1.58，HIF-1α及CypA的表達(dá)在低氧1h及3h均上升，與對(duì)照組比較，HIF-1α升高為2.062，4.

8、739倍；CypA升高為2.058，20.833倍。BXPC-3細(xì)胞干擾HIF-1α后，HIF-1α表達(dá)下降，CypA的表達(dá)亦下降，減低倍率分別為0.559，0.187。MIA-paca-2細(xì)胞過(guò)表達(dá)HIF-1α后，HIF-1α的表達(dá)上升，CypA的表達(dá)也上升，升高倍率分別為3.22，1.88。
　　第二部分：CypA對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響及機(jī)制探討劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：BXPC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-HIF-1α或siRNA-Cyp

9、A后Oh、6h、12h、24h劃痕間距。至24h，對(duì)照組較干擾HIF-1α及CypA組劃痕間距大，p<0.05。給BXPC-3細(xì)胞2ME、CsA或兩者聯(lián)合后Oh、6h劃痕間距在各組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；12h，CsA組與2ME+CsA組劃痕間距較對(duì)照組大(p<0.05)；24h，2ME+CsA組細(xì)胞劃痕間距大于低于單藥組及對(duì)照組(p<0.05)。Transwell結(jié)果顯示：干擾HIF-1α與CypA后12h，24h穿過(guò)膜的細(xì)

10、胞數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，48h干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(p<0.05)。干擾HIF-1α，CypA的表達(dá)后，OD值低于對(duì)照組；6h，12h，48h三給藥組穿膜細(xì)胞均明顯少于對(duì)照組(p<0.05)。2ME+CsA組穿膜細(xì)胞數(shù)量最少(p<0.01)。結(jié)晶紫染色OD值給藥組均較對(duì)照組明顯減低，p<0.05。MTT顯示：，0-24h干擾組與未干擾組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；48h-72h，干擾HIF-1α與CypA組的OD值較對(duì)照組減

11、低，p<0.05。三給藥組OD值均降低，聯(lián)合用藥組OD值最低，兩藥物存在協(xié)同作用，協(xié)同指數(shù)為0.58。流式細(xì)胞術(shù)顯示：與對(duì)照組相比，2ME組細(xì)胞凋亡百分比稍有增加但統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異(p>0.05)，CsA組增加較為明顯，p<0.05，藥物聯(lián)合組凋亡增加明顯，達(dá)到細(xì)胞總數(shù)的21.5％，與對(duì)照組及單藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。干擾HIF-1α，CypA后，細(xì)胞的凋亡百分比增加；單獨(dú)干擾CypA與HIF-1α組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、(p>0.05)，僅當(dāng)共轉(zhuǎn)染兩種蛋白的Si-RNA，與單獨(dú)干擾組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.997，p<0.05)。給予BXPC-3細(xì)胞抑制HIF-1α及CypA的表達(dá)后，細(xì)胞周期改變不明顯，各細(xì)胞周期均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.599，p>0.05)。定量PCR顯示：干擾Si-RNA-HIF-1α及CypA與對(duì)照著相比，ERK、NFkB的mRNA表達(dá)減低(p<0.05)；2ME組與對(duì)照組相比，ERK的表達(dá)下降(p<0.05)，但NFkB

13、，P53，ERK的mRNA表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；CsA組與對(duì)照組相比，ERK、NFkB的mRNA表達(dá)減低(p>0.05)；2ME+CsA組與對(duì)照組相比，CypA，HIF-1α的mRNA表達(dá)均下降，P53的mRNA表達(dá)升高，為對(duì)照組4.2倍(p<0.01)。半定量PCR顯示：2ME組與對(duì)照組相比，MMPs的mRNA表達(dá)均無(wú)明顯變化；CsA組MMPs的表達(dá)下降(p<0.05)；2ME+CsA組，MMP3與MMP9減少(p<0.

14、05)。干擾HIF-1α后，MMP3的mRNA表達(dá)減少；干擾CypA后，MMP2/3的mRNA表達(dá)均減少(p<0.05)。Western blot：干擾HIF-1α與對(duì)照組相比，CypA的蛋白表達(dá)下降，而P53的蛋白表達(dá)增加。ERK1/2及磷酸化ERK、NFkB的表達(dá)下降，2ME組，HIF-1α及CypA蛋白的表達(dá)為對(duì)照組的0.21、0.11倍，P53的蛋白表達(dá)增加，NFkB，p-ERK1/2，ERK1/2的蛋白表達(dá)在各給藥組均比對(duì)照組

15、減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫熒光技術(shù)結(jié)果：對(duì)照組與CsA組相比HIF-1α的蛋白表達(dá)相近，細(xì)胞核與細(xì)胞漿中均有明顯表達(dá)；與對(duì)照組相比，2ME組和2ME+CsA組細(xì)胞核中HIF-1α的蛋白表達(dá)下降。各給藥組與對(duì)照組相比CypA的蛋白表達(dá)下降，2ME+CsA組下降最為明顯。與對(duì)照組相比，2ME、CsA、2ME+CsA組P53的蛋白表達(dá)逐漸增高，NFkB，ERK1/2表達(dá)減少，在2ME+CsA組ERK1/2的蛋白幾無(wú)表達(dá)。
　　結(jié)論：<

16、br>　　1.HIF-1α可通過(guò)與CypA啟動(dòng)子區(qū)第二位HRE結(jié)合調(diào)節(jié)CypA的表達(dá)。
　　2.HIF-1α與CypA的表達(dá)增高可增加細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移能力，抑制劑2ME及CsA可通過(guò)上調(diào)P53的表達(dá)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，通過(guò)抑制ERK1/2/NFkB/MMP2，3，9的表達(dá)而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移能力。
　　3.CsA與2ME可抑制移植瘤小鼠腫瘤的增生，二者聯(lián)合應(yīng)用的效果更加明顯，但可導(dǎo)致致命性肝腎功能損害。