MiR-200a對(duì)人胰腺癌干細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及體外生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　研究miR-200a對(duì)從人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1分選出的胰腺癌干細(xì)胞(Pancreatic cancer stem cells,PCSCs)EMT及體外生物學(xué)行為的影響。探索靶向調(diào)控胰腺癌干細(xì)胞中miR-200a的表達(dá)在預(yù)防及治療胰腺癌方面的可行性。
　　方法：
　　(1)細(xì)胞培養(yǎng)和流式細(xì)胞儀分選
　　將人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞接種于由含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素(10U/ml

2、)和鏈霉素(100μg/ml)組成的培養(yǎng)基中,在5％CO2,飽和濕度,恒溫37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分散后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),移至5ml的試管中,用PBS洗滌兩次,以1×106/100μl重新懸浮于PBS中。分別加入抗人CD24-PE、抗人CD44-APC和抗人ESA-FITC抗體(稀釋度均為1:40),避光冰上孵育20min。根據(jù)廠商說(shuō)明書將各自同型對(duì)照抗體配成相同濃度使用。PBS洗滌2次,樣本用500μl PBS重懸,進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選。細(xì)胞

3、常規(guī)分選兩次,并重新分析的純度,保證分選后的細(xì)胞純度>97％。數(shù)據(jù)用BD FACS Diva的軟件進(jìn)行分析。
　　(2)轉(zhuǎn)染miR-200模擬物
　　將CD24+CD44+ESA+胰腺癌干細(xì)胞接種在6孔板中并孵育過(guò)夜。將含miR-200模擬物或者陰性對(duì)照序列的EntransterTM-R轉(zhuǎn)染液(配制成終濃度25nM)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后更換培養(yǎng)液以避免細(xì)胞死亡。
　　(3)實(shí)時(shí)定量RT-PCR
　　根據(jù)說(shuō)明書用

4、Trizol法提取總RNA,使用Power SYBR_ green PCR master mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析E-cadherin、N-cadherin、vimentin、ZEB1、Oct4和Nanog的mRNA表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參照。
　　(4)microRNA表達(dá)分析
　　使用miScript Reverse Transcription Kit逆轉(zhuǎn)錄細(xì)胞總RNA。使用miScript PCR Ki

5、t進(jìn)行RT-qPCR分析轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組胰腺癌干細(xì)胞miR-200a表達(dá)水平。以U6為內(nèi)參照。
　　(5)Western blot檢測(cè)
　　用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE分離總蛋白并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜。配制含5％脫脂奶粉、0.1％Tween20的TBST緩沖溶液封閉膜,加一抗(兔抗人Oct4, l:2000;兔抗人Nanog,1:2000;兔抗人N-cadherin,1:1000;

6、鼠抗人Vimentin,1:500;兔抗人E-cadherin,1:1000;兔抗人ZEB1,1:1000)室溫孵育2小時(shí)。再加入HRP-偶聯(lián)的二抗(HRP-羊抗兔IgG抗體,1:5000;HRP-羊抗小鼠IgG抗體,1:5000)室溫孵育1小時(shí),增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。提取未轉(zhuǎn)染和已轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot,檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、vimentin、Oc

7、t4和Nanog蛋白表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參照。
　　(6)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)
　　1×105PCSCs被平鋪于非涂覆膜的上室,使其可以朝向下室中含血清的培養(yǎng)基遷移。孵育48小時(shí)后多聚甲醛固定細(xì)胞,以0.1％結(jié)晶紫(2mg/ml)染色。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)通過(guò)膜孔遷移的細(xì)胞數(shù)量。每孔觀察3個(gè)隨機(jī)視野。
　　(7)Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)
　　1×105PCSCs置于Matrigel涂覆膜的

8、上室,檢測(cè)前每孔涂覆Matrigel60mg。細(xì)胞平鋪在不含血清或生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中,而添加血清的培養(yǎng)基被用作化學(xué)誘導(dǎo)劑置于下室中。將細(xì)胞孵育48小時(shí)后,用棉簽除去未通過(guò)膜孔侵入下室的細(xì)胞。收集膜下表面的細(xì)胞,用多聚甲醛固定和0.1％結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)侵入到膜下表面的細(xì)胞數(shù)量。每孔觀察3個(gè)隨機(jī)視野。
　　(8)CCK法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力和對(duì)吉西他濱敏感性
　　調(diào)整各組細(xì)胞密度,按照每孔1000-3000個(gè)細(xì)胞/10

9、0μl培養(yǎng)基接種于96孔板中,各孔在不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h、96h)或者在加入不同濃度(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、2000ng/ml)吉西他濱后72h加入10μlCCK-8,37℃、5％CO2孵育3h。用酶標(biāo)檢測(cè)儀(測(cè)定波450 nm)測(cè)定各孔吸光密度值。
　　結(jié)果：
　　(1)在PNC-1細(xì)胞中有(1.442±0.532)％細(xì)胞呈CD44+CD24+

10、,而僅有(0.492±0.334)％細(xì)胞呈CD44+CD24+ESA+。Oct4和Nanog基因在CD44+CD24+ESA+細(xì)胞中表達(dá)顯著上升。
　　(2)定時(shí)RT-PCR顯示miR-200a、E-cadherin在PCSCs中表達(dá)顯著下調(diào),而N-cadherin、vimentin和ZEB1表達(dá)則顯著上調(diào)。
　　(3)在PCSCs中過(guò)表達(dá)miR-200a導(dǎo)致在mRNA水平上上皮表型標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào),而間質(zhì)

11、表型標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和ZEB1和胚胎干性基因Oct4和Nanog表達(dá)下調(diào)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示PCSCs過(guò)表達(dá)miR-200a后E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào),ZEB1、N-cadherin、Oct4和Nanog蛋白表達(dá)下調(diào),而Vimentin蛋白表達(dá)未見下調(diào)。
　　(4)Transwell實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染組相比非轉(zhuǎn)染組或陰性對(duì)照組遷移和侵襲至膜下表面的細(xì)胞數(shù)目顯著減少,分別下降了0.33