miR-200a和miR-429對胰腺星狀細胞上皮間質轉化和纖維化的調控作用及其機制.pdf

1、慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是由多種因素作用使胰腺組織結構和功能發(fā)生持續(xù)的損害，典型的病理改變?yōu)橐认俳M織纖維化、腺泡萎縮、炎性細胞浸潤，而纖維化的主要特點是大量成纖維細胞增生和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)異常沉積，其具體發(fā)病機制目前仍不清楚，因此迫切需要從分子水平明確胰腺組織纖維化的具體發(fā)病機制，為進一步尋找相應的干預途徑和分子靶向治療奠定基礎。
　　上皮細胞間質轉

2、化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞發(fā)生了形態(tài)學變化，即由有極性、靜息態(tài)的上皮細胞向無極性、運動活躍的間充質樣細胞轉化的過程，并且具有侵襲和運動能力。ECM對EMT的發(fā)生起著重要的作用，EMT是胰腺組織向纖維化發(fā)展的起始階段，而活化的胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells，PSCs)是胰腺纖維化的核心環(huán)節(jié)，目前在胰腺纖維化的過程中PSCs的激活如何調控EC

3、M的合成和EMT的進程尚不清楚。
　　MicroRNA是一種具有調控功能但不具備編碼功能的小RNA，主要使靶mRNA降解或者阻遏其翻譯來負向調控或沉默靶mRNA的表達。miRNA對EMT的調控作用越來越引起國內外學者的關注，其中miR-200家族是最重要的一類。研究發(fā)現(xiàn)在肺纖維化過程中miR-200家族成員miR-200a、miR-200b、miR-200c的表達顯著下降，而上調miR-200a、miR-200b、miR-200c

4、可逆轉TGF-β1誘導的肺泡細胞EMT;在TGF-β1刺激HSCs活化的過程中，內源性miR-200a的表達是下降的，過表達miR-200a可以顯著抑制α-SMA的活力以及活化HSCs的增殖。
　　本研究主要探討miR-200a和miR-429對TGF-β1誘導的PSCs EMT和纖維化的影響及其作用機制，為miR-200家族作為抑制或逆轉PSCs活化和胰腺纖維化的治療靶點提供分子生物學基礎，為胰腺纖維化的基因治療提供理論依據，進

5、而探索一種干預治療慢性胰腺炎胰腺組織纖維化的方法。
　　目的:探討miR-200a和miR-429對TGF-β1誘導的PSCs EMT和纖維化的影Ⅱ向及其作用機制。
　　方法:用組織塊分離法提取培養(yǎng)PSCs，免疫熒光染色法檢測結蛋白(Desmin)、神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA)的表達鑒定PSCs。取新鮮培養(yǎng)的第2代PSCs作為研究對象，10 ng/mL TGF-β1刺激PSCs72 h

6、，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學改變;qRT-PCR、Western blot、細胞免疫熒光染色法檢測α-SMA、 E-鈣黏蛋白(E-cad)、波形蛋白(Vimentin)、Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)mRNA及蛋白的表達水平;Western blot檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白PTEN、Akt、P-Akt的表達量。PI3K特異性抑制劑LY294002阻斷Akt通路后，qRT-PCR、Western blot、細胞免疫熒光染

7、色法檢測α-SMA、E-cad、Vimentin、collagenⅠ mRNA及蛋白的表達水平;分別轉染miR-200a/429 mimic至各組PSCs，qRT-PCR檢測miR-200a和miR-429 mRNA的表達水平，采用熒光定量PCR、Western blot、細胞免疫熒光染色法檢測各組α-SMA、E-cad、Vimentin、collagenⅠ mRNA及蛋白的表達情況。Western blot分別檢測PI3K/Akt和T

8、GF-β/Smad相關信號通路蛋白的表達情況。
　　結果:新鮮分離的PSCs在倒置顯微鏡下觀察向四周伸出突起，呈星形或不規(guī)則狀，細胞核與質比例較大，可見到貯脂顆粒，細胞免疫熒光染色顯示GFAP、desmin表達陽性，α-SMA表達陰性，符合星狀細胞的生物學特征。PSCs經TGF-β1刺激后，倒置顯微鏡下觀察細胞體積變大，偽足發(fā)達，細胞間連接減少，脂滴消失，呈典型的活化狀態(tài);qRT-PCR、Western blot及細胞免疫熒光染色

9、顯示α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ的mRNA及蛋白的表達量顯著增加，而E-cad的表達量顯著降低;通路蛋白PTEN的表達量較對照組明顯減少，而P-Akt蛋白的表達量明顯增多(P＜0.05)，總Akt的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。LY294002阻斷Akt通路后，發(fā)現(xiàn)活化的PSCs中α-SMA、Vimentin、 CollagenⅠ的mRNA及蛋白的表達量明顯降低，而E-cad的表達量明顯增加(P＜0.05

10、)。轉染miR-200a mimic后，在相同濃度的TGF-β1刺激下，α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ的mRNA及蛋白的表達量明顯降低，而E-cad的表達量明顯增加(P＜0.05);PI3K/Akt通路相關蛋白PTEN的表達量增多，而P-Akt、P-mTOR蛋白的表達量明顯減少(P＜0.05)，總Akt和總mTOR蛋白在各組間的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。轉染miR-429 mimic后，Western bl

11、ot結果顯示α-SMA、Vimentin、 CollagenⅠ蛋白的表達量明顯降低，而E-cad的表達量明顯增加，TGF-β、P-Smad2/3、ZEB1、ZEB2的蛋白表達量亦顯著減少（P＜0.05），總Smad2/3在各組間的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論:miR-200a通過調控PI3/Akt能夠抑制TGF-β1誘導的PSCs活化及ECM的沉積，逆轉EMT，從而為慢性胰腺炎胰腺纖維化治療提供基因學依據;mi