MiR-541調(diào)控納米SiO2致大鼠肺纖維化中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用機(jī)制研究.pdf

1、納米二氧化硅(silicon dioxide，SiO2)由于其獨(dú)特的理化性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于涂料、化妝品、催化劑、建筑材料、生物醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，人群職業(yè)暴露的機(jī)會(huì)不斷增加，其生物安全性仍不明確。近年來動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，納米SiO2短期暴露可引起嚴(yán)重的肺部炎癥乃至動(dòng)物死亡，長期暴露則可致肺纖維化。因其纖維化的機(jī)制尚不完全清楚，且人群多為低劑量長期暴露，是否可引起肺纖維化尚未有足夠的證據(jù)，所以揭示納米SiO2致肺纖維化發(fā)生的分子機(jī)制可以其慢性、亞慢

2、性毒性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，也可其致肺纖維化作用提供早期敏感標(biāo)志物及有效作用靶點(diǎn)。
　　肺纖維化是一類由多種病因引起的肺組織損傷、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、成纖維細(xì)胞聚集、細(xì)胞外基質(zhì)沉積及肺組織結(jié)構(gòu)異常重塑的不可逆性疾病。肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞可通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)轉(zhuǎn)變?yōu)槌煞纬衫w維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞，是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要細(xì)胞生物學(xué)事件。游離SiO2、博來霉素、百草枯、放射性物

3、質(zhì)所致肺纖維化及特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)均被證實(shí)與EMT相關(guān)，納米SiO2致肺纖維化的過程也可能發(fā)生EMT。EMT的發(fā)生與多種細(xì)胞生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor beta，TGF-β)、纖維母細(xì)胞生長因子(Fibroblast GrowthFactor，F(xiàn)GF)、胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Fact

4、or，IGF)、結(jié)締組織生長因子(Connective TissueGrowth Factor，CTGF)等密切相關(guān)，TGF-β被認(rèn)為是EMT最關(guān)鍵的誘導(dǎo)因子。TGF-βⅢ型受體(TGF-βreceptor typeⅢ，TGF-β RⅢ)是TGF-β通路的輔助受體，與TGF-β有很高的親和力，其功能是通過與TGF-β結(jié)合后將TGF-β傳遞給TGF-β RⅠ和TGF-β RⅡ從而增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路。纖維母細(xì)胞生長因子7(Fibrobl

5、ast Growth Factor7，F(xiàn)GF7)是FGF家族中重要的一員，在急性肺損傷中具有促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞增生、分化的作用。TGF-β RⅢ及FGF7的過表達(dá)與肺纖維化中EMT的發(fā)生有關(guān)。微小RNA(microRNAs，miRNAs)作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子近年來被證實(shí)與多種肺纖維化疾病密切相關(guān)，miRNAs是EMT主要的調(diào)控因子，在EMT發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本課題組前期的研究表明，納米SiO2經(jīng)氣管一次性灌注后可致大鼠肺損傷，染塵

6、7d、15d、30d主要表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，染塵60d、90d主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)纖維化;高通量測(cè)序結(jié)果表明miR-541是納米SiO2染塵60d、90d大鼠肺組織中表達(dá)下調(diào)的miRNA，推測(cè)miR-541可能通過調(diào)控EMT在納米SiO2致大鼠肺間質(zhì)纖維化中發(fā)揮作用。為闡明miR-541在納米SiO2致大鼠肺纖維化中的生物學(xué)作用及明確miR-541與TGF-β信號(hào)通路、EMT關(guān)系，本研究將從整體動(dòng)物和體外細(xì)胞兩個(gè)水平來探討其分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7、如下:
　　1.用TargetScan數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-541進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示預(yù)測(cè)靶基因共83個(gè)。用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)83個(gè)預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行基因富集和信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，miR-541在TGF-β受體信號(hào)通路和細(xì)胞分化的調(diào)控比較顯著。根據(jù)本課題組前期的病理結(jié)果及上述生物信息學(xué)分析結(jié)果，本研究將TGF-β RⅢ、FGF7確定為miR-541重要的預(yù)測(cè)靶基因;miR-541可通過調(diào)控TGF-β受體信號(hào)通路和FGF通路在肺泡上皮細(xì)

8、胞的分化過程中發(fā)揮作用。
　　2.RT-qPCR結(jié)果顯示，在納米SiO2染塵7d、15d、30d、60d、90d大鼠肺組織中miR-541及E-cad mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組比較均顯著下調(diào)(差異倍數(shù)≤-2)，隨染塵時(shí)間延長呈下調(diào)趨勢(shì)(P＜0.05），60d、90d分別較7d、15d、30d顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); FGF7 mRNA在各染塵時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與對(duì)照組比較均顯著上調(diào)(P＜0.05），TGF-β1、T

9、GF-β RⅢ和COLⅢ mRNA在60d、90d顯著上調(diào)(P＜0.05）;α-SMA mRNA在染塵30d、60d、90d顯著上調(diào)(P＜0.05); TGF-β RⅢ、FGF7、TGF-β1、α-SMA、COLⅢmRNA的表達(dá)水平隨染塵時(shí)間變化均呈上調(diào)趨勢(shì)（P＜0.05），60d、90d分別較7d、15d、30d顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。Western Blot結(jié)果表明，E-cad蛋白的表達(dá)水平在染塵60d、90d與

10、對(duì)照組比較顯著下調(diào)(P＜0，05)，隨染塵時(shí)間延長呈下調(diào)趨勢(shì)(P＜0.05)，60d、90d分別較7d、15d、30d顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); TGF-β RⅢ、FGF7、TGF-β1、α-SMA、COLⅢ蛋白的表達(dá)水平在染塵30d、60d、90d與對(duì)照組比較均顯著上調(diào)（P＜0.05），60d、90d分別較7d、15d、30d顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示，將T

11、GF-β RⅢ、FGF73'UTR野生型的雙熒光素酶報(bào)告載體分別與miR-541 mimic、mimic NC共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，熒光素酶活性水平與mimic NC組比較顯著降低，報(bào)告相對(duì)熒光值分別為（65±9）％、（35±4）％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;將位點(diǎn)突變后的雙熒光素酶報(bào)告載體再分別與miR-541 mimic、mimic NC共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，報(bào)告相對(duì)熒光值分別為（99±14）％、(90±3)％，與mimic

12、 NC組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。上述結(jié)果提示TGF-β RⅢ和FGF7是miR-541的靶基因，miR-541通過直接靶向調(diào)控TGF-β RⅢ和FGF7從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。
　　3.用5ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)48h后，可觀察到A549細(xì)胞由上皮樣向成纖維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變，RT-qPCR及Western Blot結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，miR-541，E-cad mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著下調(diào)(差異倍數(shù)≤-2

13、)，α-SMA、COLⅢ、TGF-β RⅢ、FGF7 mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P＜0.05);采用受體阻斷劑(receptor blocker，RB)誘導(dǎo)3h后再經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)48h后未觀察到A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，RT-qPCR及Western Blot結(jié)果表明，E-cad、α-SMA、COLⅢ mRNA及其蛋白的表達(dá)水平無明顯變化，miR-541、TGF-β RⅢ、FGF7 mRNA的表達(dá)亦無明顯改變(P＞0

14、.05)。miR-541mimic、mimic NC、miR-541inhibitor和inhibitor NC分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24h再經(jīng)5ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)48h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞的增殖率分別為（115±7）％、（106±3）％、（97±8）％、（103±3）％，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），鏡下均未觀察到A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變;但RT-qPCR及Western Blot結(jié)果表明miR-541 inhib

15、itor轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞中miR-541、E-cad mRNA與蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，α-SMA、COLⅢ、TGF-β RⅢ及FGF7 mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P＜0.05)。miR-541 mimic轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞中miR-541顯著上調(diào)，TGF-βRⅢ mRNA、FGF7 mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)水平均下調(diào)，E-cad、α-SMA和COLⅢ mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均無明顯變化;mimic NC轉(zhuǎn)染組和inhibi

16、tor轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞中miR-541，TGF-β RⅢ、FGF7、E-cad、α-SMA和COLⅢ mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均無明顯變化(P＞0.05)。結(jié)果表明TGF-β1可抑制miR-541的表達(dá)從而促進(jìn)EMT的發(fā)生，過表達(dá)的miR-541有減弱TGF-β及FGF通路的作用，進(jìn)而抑制EMT的發(fā)生。
　　綜上所述，納米SiO2致大鼠肺纖維化的過程中發(fā)生了EMT，TGF-β RⅢ和FGF7是miR-541的靶基因。miR-54