腎間質(zhì)纖維化中的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)型及Snaill的作用研究.pdf

1、慢性腎臟疾?。–hronic Kidney Disease，CKD）常因起病隱匿，面臨著高發(fā)病率、高住院率、高死亡率及高額治療費(fèi)用等問(wèn)題，已成為威脅人類(lèi)健康的隱形殺手，對(duì)人類(lèi)生存質(zhì)量及社會(huì)發(fā)展構(gòu)成極大危害。目前認(rèn)為，CKD的發(fā)展是一種不可逆的過(guò)程，最終將形成廣泛的腎間質(zhì)纖維化，并發(fā)展為終末期腎衰。而腎間質(zhì)纖維化（RenAlInterstitiAlFibrosis）被認(rèn)為是所有慢性進(jìn)行性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰的共同組織學(xué)特點(diǎn)，在CKD進(jìn)

2、程中起主導(dǎo)作用。
　　 腎間質(zhì)纖維化特征性的表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）聚集和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)陽(yáng)性肌成纖維細(xì)胞（Myofibroblast）的大量增殖。而肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中ECM合成和沉積的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，在CKD中起重要作用，但其確切來(lái)源目前仍不清楚。1995年，Strutz等首次提出腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中存在上皮

3、-間充質(zhì)轉(zhuǎn)型（Epithelial-MesenchymAlTransition，EMT）現(xiàn)象，并認(rèn)為腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中出現(xiàn)的肌成纖維細(xì)胞是由腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT產(chǎn)生的，但此觀點(diǎn)至今仍無(wú)定論。
　　 為此，本課題也試圖通過(guò)體外誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞和體內(nèi)小鼠的單側(cè)輸尿管梗阻（UnilaterAlUreterAlObstruction, UUO）模型來(lái)研究腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中是否存在EMT現(xiàn)象及其分子機(jī)制。
　

4、　 在體外細(xì)胞模型研究中，本課題首先從形態(tài)學(xué)上觀察了TGF-β1（5ng/ml）、EGF（10ng/ml）單獨(dú)或TGF-β1（5ng/ml）/EGF（10ng/ml）聯(lián)合作用對(duì)HK-2細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，TGF-β1單獨(dú)或TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞后，HK-2細(xì)胞在形態(tài)上均發(fā)生了EMT現(xiàn)象，而且TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)的效果更理想。據(jù)此，本研究選擇了TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞作為體外研究腎小管上皮細(xì)胞

5、發(fā)生EMT現(xiàn)象的模型。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/EGF聯(lián)合作用HK-2細(xì)胞后，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度和遷移速度均明顯增加，提示TGF-β1/EGF聯(lián)合作用HK-2細(xì)胞后，細(xì)胞的表型可能發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)變。進(jìn)一步采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞后，上皮細(xì)胞標(biāo)志CK18、E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Vimentin的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后的HK-2細(xì)胞上皮細(xì)胞分子標(biāo)志CK18和E-cad

6、herin均明顯下降，而間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志Vimentin的表達(dá)則升高，從上皮標(biāo)志物下調(diào)和間充質(zhì)標(biāo)志物上調(diào)判斷TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞確實(shí)發(fā)生了EMT。
　　 為了探討TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT的分子機(jī)制，本研究通過(guò)RT-PCR和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)了EMT相關(guān)的分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Snail1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平在TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程中明顯升高，提示S

7、nail1參與了TGF-β1/EGF誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程。進(jìn)一步通過(guò)免疫印跡研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/EGF誘導(dǎo)后的HK-2細(xì)胞中，ERK1（p44）/ERK2（p42）的磷酸化水平很高，提示TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中Snail1的高表達(dá)是通過(guò)ERK通路調(diào)控的，即ERK通路介導(dǎo)調(diào)控Snail1的增高，從而導(dǎo)致了TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生明顯EMT。
　　 為了進(jìn)一步證實(shí)ERK通路介導(dǎo)

8、了TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中Snail1的高表達(dá)，本研究利用ERK通路抑制劑U0126，研究其對(duì)TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)后的HK-2細(xì)胞中，Snail1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平以及細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的影響。結(jié)果顯示，ERK通路抑制劑U0126抑制了TGF-β1/EGF誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化水平以及Snail1的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)抑制了TGF-β1/EGF誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)改變，但并未抑制Snai

9、l1的轉(zhuǎn)錄水平，提示U0126可通過(guò)抑制ERK通路中p44/42的磷酸化水平，進(jìn)而在蛋白水平抑制Snail1的表達(dá)量，最終抑制了TGF-β1/EGF誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程。
　　 在體內(nèi)小鼠腎間質(zhì)纖維化模型研究中，本課題首先建立了小鼠的UUO模型，在此基礎(chǔ)上本研究著重對(duì)小鼠UUO術(shù)后14天前的手術(shù)側(cè)腎臟進(jìn)行了組織病理學(xué)研究，結(jié)果顯示，小鼠UUO術(shù)后，手術(shù)側(cè)腎臟隨術(shù)后時(shí)間的增加，腎間質(zhì)纖維化的程度越來(lái)越嚴(yán)重，提示小鼠U

10、UO模型可用于小鼠腎間質(zhì)纖維化的研究。進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光組織化學(xué)和免疫印跡等方法研究了體內(nèi)腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中是否存在EMT及EMT相關(guān)分子的變化情況，結(jié)果顯示，UUO術(shù)后腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)降低，肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA增加，同時(shí)觀察到少量腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α-SMA，表明小鼠體內(nèi)腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中存在EMT現(xiàn)象。對(duì)腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中EMT相關(guān)分子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，明膠酶MMP2和MMP9在14天

11、內(nèi)有增高，提示明膠酶可能參與纖維的降解和平衡，并有助于促進(jìn)腎小管細(xì)胞通過(guò)基底膜發(fā)生遷移；腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)PAX2陽(yáng)性細(xì)胞增多，提示成熟的腎小管上皮細(xì)胞在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹竽I間充質(zhì)樣細(xì)胞；研究還發(fā)現(xiàn)，在腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程中皮質(zhì)間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了表達(dá)BMP7的細(xì)胞，其細(xì)胞類(lèi)型和作用有待進(jìn)一步證實(shí)；轉(zhuǎn)錄因子Snail1持續(xù)上調(diào)，提示Snail1在體內(nèi)腎間質(zhì)纖維化中具有重要作用。
　　 為了更好的研究轉(zhuǎn)錄因子Snail1瞬時(shí)

12、高表達(dá)對(duì)HK-2細(xì)胞的表型影響，本研究還構(gòu)建了人Snail1的重組腺病毒載體，并成功的包裝了腺病毒，Snail1重組腺病毒感染HK-2細(xì)胞后，形態(tài)觀察顯示，細(xì)胞的形態(tài)由上皮樣轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維樣。通過(guò)RT-PCR、免疫印跡和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法證實(shí)，Snail1重組腺病毒感染的細(xì)胞中，上皮標(biāo)志E-cadherin的表達(dá)減少，與E-cadherin相關(guān)的β-catenin從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志α-SMA上調(diào)，明膠酶MMP2和M

13、MP9的轉(zhuǎn)錄水平較高。提示所獲得的腺病毒可以直接導(dǎo)致HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象，這為后續(xù)將進(jìn)行的Snail1對(duì)下游分子的調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 總之，本研究通過(guò)體內(nèi)外的手段研究了腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中的EMT現(xiàn)象并探討了Snail1在其中的作用，研究結(jié)果得出以下結(jié)論：①TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)可導(dǎo)致人腎近端小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞發(fā)生明顯的EMT現(xiàn)象，其分子機(jī)制是TGF-β1/EGF協(xié)同作用進(jìn)一步促進(jìn)ERK1/2（p44/4

14、2）的磷酸化，ERK通路進(jìn)一步上調(diào)Snail1，從而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生明顯EMT現(xiàn)象；抑制ERK1/2（p44/42）的磷酸化，可以抑制Snail1的蛋白水平，從而抑制EMT。這具有一定的創(chuàng)新性，進(jìn)一步豐富了人們對(duì)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。②小鼠體內(nèi)腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中也存在EMT現(xiàn)象，其分子機(jī)制涉及明膠酶MMP2和MMP9、PAX2、BMP7和Snail1等多個(gè)分子，并首次發(fā)現(xiàn)在腎間質(zhì)纖維化中存在表達(dá)BMP7的細(xì)胞，

15、其細(xì)胞類(lèi)型和作用有待進(jìn)一步證實(shí)。③Snail1瞬時(shí)過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞直接發(fā)生EMT，這將為人們尋找延緩或阻止腎間質(zhì)纖維化提供新思路和新靶點(diǎn)。
　　 本研究的創(chuàng)新之處在于：①本研究首次發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/EGF聯(lián)合誘導(dǎo)人腎近端小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT的分子機(jī)制是：TGF-β1/EGF協(xié)同作用促進(jìn)ERK1/2（p44/42）的磷酸化，ERK通路進(jìn)一步上調(diào)Snail1，從而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生明顯EMT