miR-200a通過介導(dǎo)ZEB1-2的表達(dá)來調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程.pdf

1、目的：
　　通過基因技術(shù)尋找到與腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化相關(guān)聯(lián)的miRNA，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其表達(dá)變化，明確該miRNA是否參與到腹膜纖維過程。并通過RNA干擾技術(shù)，觀察 miRNA對腹膜纖維化關(guān)鍵環(huán)節(jié)腹膜間皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響。通過miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站，篩選miR-200a下游作用靶基因，觀察miR-200a對其調(diào)控作用，探討miR-200a對腹膜間皮細(xì)胞EMT的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)

2、選取6只雄性SD大鼠，平均分為對照組及實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組：腹腔注射脂多糖（LPS）+高糖腹透液液，從而構(gòu)建腹膜纖維化小鼠模型；對照組：腹腔注射生理鹽水。通過基因芯片法檢測小鼠腹膜組織miRNA相關(guān)表達(dá)譜，尋找相關(guān)差異表達(dá)的miRNAs。再通過擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本量，利用real time PCR法驗(yàn)證差異 miRNA（miR?200a）表達(dá)水平是否與基因芯片結(jié)果相符。2、體外實(shí)驗(yàn)：利用轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF?β1）刺激腹膜間皮細(xì)胞，建立體外上皮細(xì)胞

3、?間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）模型，分別用 Western印跡、細(xì)胞免疫熒光、PCR等實(shí)驗(yàn)方法來檢測人腹膜間皮細(xì)胞中Ⅰ型膠原（Col?Ⅰ）、α平滑肌肌動蛋白（α?SMA）、纖維連接蛋白（FN）、E鈣黏蛋白（E?cadherin）的表達(dá)變化及定位，real timePCR及Taqman探針法檢測腹膜間皮間皮細(xì)胞EMT模型中miR?200a的表達(dá)水平的變化；采取RNA干擾技術(shù)，利用miR-200a mimics及inhibit干預(yù)細(xì)胞，觀察其潛在

4、靶基因ZEB1/2表達(dá)變化及EMT變化。
　　結(jié)果：
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)示：基因芯片結(jié)果顯示，有差異表達(dá)的miRNA表達(dá)譜中，有8個(gè)miRNA差異倍數(shù)大于等于2倍，而在這8個(gè)miRNA中，可見miR?200a的表達(dá)明顯下調(diào)（差異倍數(shù)為3.31倍，P﹤0.05）。擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本量，即實(shí)驗(yàn)組及對照組各15只大鼠，qRT?PCR驗(yàn)證了miR?200a在腹膜組織中的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組較對照組下調(diào)2.55倍（P﹤0.05）；2、體外實(shí)驗(yàn)示：體

5、外EMT模型中發(fā)現(xiàn)：①、分別利用不同濃度TGF?β1刺激細(xì)胞及作用不同時(shí)間時(shí)，腹膜間皮細(xì)胞EMT過程出現(xiàn)濃度及時(shí)間依賴效應(yīng)，即Ⅰ型膠原（Col?Ⅰ）、α平滑肌肌動蛋白（α?SMA）、纖維連接蛋白（FN）的表達(dá)量隨著TGF?β1刺激的濃度及時(shí)間遞增而增加，同時(shí)，E鈣黏蛋白（E?cadherin）的表達(dá)量反而降低；②、分別利用TGF?β1刺激細(xì)胞不同時(shí)間后，miR?200a表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P﹤0.05）；③、與對照組對比，miR-200

6、a mimics轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后，抑制EMT進(jìn)展；而miR-200a inhibit轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后，促進(jìn)EMT進(jìn)展；④、使用miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站（miRBase、TargetScan、TarBase、miRanda），篩選miR-200a潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)ZEB1/2可能為miR-200a下游靶基因，參與腹膜間皮細(xì)胞 EMT過程；⑤、分別利用不同濃度TGF?β1刺激細(xì)胞及作用不同時(shí)間時(shí)，ZEB家族，即ZEB1和ZEB2的表達(dá)量隨著TGF?β