miR-199a-214簇促進腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化的機制研究.pdf

1、終末期腎病在目前是一種常見并且嚴重的疾病,調(diào)查表明腹膜透析(peritoneal dialysis PD)比血液透析有較低的死亡率,但隨著透析時間延長這種優(yōu)勢往往會消失。這與腹膜發(fā)生纖維化有著很大的關(guān)系。目前研究表明間皮細胞轉(zhuǎn)分化可引發(fā)大量肌成纖維細胞的生成導致纖維化。腹膜發(fā)生纖維化的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是人腹膜間皮細胞(Human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-to-me

2、senchymal transition,EMT)[3],腹膜間皮細胞EMT在是一個復雜的動態(tài)過程,有多種因素參與,檢測證實在EMT的過程中其誘導間皮細胞標志分子表達,而上皮細胞的標志分子表達受到抑制。EMT是腹膜纖維化病理過程的早期階段,而且在其發(fā)生的初期是一個可逆的過程,因此EMT是干預早期腹膜纖維化的一個重要的研究方向。研究表明,miRNA的失調(diào)導致各種疾病,如癌癥,心血管疾病和纖維化[4]。并且miRNA在與EMT有關(guān)的器官的纖

3、維化中,包括心臟,肝臟,肺,腎中發(fā)揮作用。miRNA還是疾病治療的目標和診斷一些疾病的標志。然而,在腹膜間皮細胞EMT和腹膜纖維化中miRNA的作用仍不清楚。本課題對miR-199a/214簇在腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化中的機制進行了相關(guān)的研究。
　　【目的】
　　1.miR-199a/214簇在人腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化中的表達變化。
　　2.上調(diào)、下調(diào)miR-199a/214簇對人腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響。
　　3.miR

4、-199a/214簇通過CDH1/CLDN2通路參與EMT過程的機制研究。
　　【方法】
　　1.用高糖培養(yǎng)永生化HPMCs48 h后,免疫熒光細胞化學方法檢測E-cadherin和Claudin2的表達。高糖培養(yǎng)永生化的HPMCs不同時間后,PCR檢測miR-199a/214的表達以及Western blot檢測上皮細胞標志分子E-cadherin和Claudin2蛋白的表達。
　　2.在不同透齡PD患者原代培養(yǎng)的H

5、PMCs中PCR檢測miR-199a/214的表達以及Western blot檢測上皮細胞標志分子E-cadherin和Claudin2蛋白的表達。
　　3.用高糖透析液處理大鼠使其發(fā)生腹膜纖維化,原位雜交檢測 miR-199a和miR-214在纖維化腹膜中的表達。
　　4.體外高糖培養(yǎng)HPMCs,上調(diào) miR-199a/214簇后觀察細胞形態(tài)學變化,體外及活體內(nèi)實驗上調(diào) miR-199a/214簇后,免疫熒光細胞化學方法檢

6、測上皮細胞標志分子E-cadherin和Claudin2及間皮標志分子ɑ-平滑肌肌動蛋白(ɑ-smooth muscle actin,ɑ-SMA)的表達;Western blot檢測顯示上調(diào)miR-199a/214簇后E-cadherin和Claudin2蛋白的表達。
　　5.體外高糖培養(yǎng)HPMCs,下調(diào) miR-199a/214簇后觀察細胞形態(tài)學變化,體外及活體內(nèi)實驗下調(diào) miR-199a/214簇后,免疫熒光細胞化學方法檢測上

7、皮細胞標志分子E-cadherin和Claudin2及間皮標志分子α-SMA的表達;Western blot檢測顯示上調(diào)miR-199a/214簇后E-cadherin和Claudin2蛋白的表達。
　　6.雙熒光素酶報告檢測miR-199a/214簇的靶基因是否為CDH1和CLDN2基因。
　　【結(jié)果】
　　1.用高糖培養(yǎng)永生化HPMCs48 h后,免疫熒光細胞化學檢測對照組E-cadherin和Claudin2廣泛

8、表達;而高糖刺激永生化的HPMCs中上皮細胞標志分子E-cadherin和Claudin2的表達明顯減弱。高糖培養(yǎng)永生化的HPMCs隨時間延長,Western blot檢測E-cadherin和Claudin2蛋白表達水平逐漸降低,而PCR檢測miR-199a/214簇則逐漸升高。
　　2.Western blot檢測不同透齡PD患者原代培養(yǎng)的HPMCs中E-cadherin和Claudin2蛋白表達水平隨透齡延長明顯降低,而PC

9、R檢測miR-199a/214簇則逐漸升高。
　　3.原位雜交實驗,miR-199a/214在大鼠腹膜纖維化組表達明顯增強,E-cadherin和Claudin2的表達明顯降低。
　　4.體外實驗上調(diào) miR-199a/214簇后對照組HPMCs呈鋪路石狀,mimic組細胞形態(tài)呈梭形纖維狀。體外及活體內(nèi)實驗上調(diào) miR-199a/214簇后,免疫熒光細胞化學檢測示E-cadherin和Claudin2表達減弱而ɑ-SMA的表

10、達增強;Western blot檢測顯示上調(diào)miR-199a/214簇后E-cadherin和Claudin2的表達減弱(P<0.05)。
　　5.體外實驗高糖培養(yǎng) HPMCs后下調(diào) miR-199a/214簇后,對照組細胞呈鋪路石及梭形混合存在,inhibitor組細胞形態(tài)呈鋪路石狀。體外及活體內(nèi)實驗下調(diào)miR-199a/214簇后,免疫熒光細胞化學檢測示 E-cadherin和Claudin2表達增強而ɑ-SMA的表達減弱;W

11、estern blot檢測顯示下調(diào)miR-199a/214簇后E-cadherin和Claudin2的表達增強(P<0.05)。
　　6.雙熒光素酶檢測分析:miR-214及 miR-199a-5p均能抑制 CDH1及 CLDN2表達,證實CDH1和CLDN2是miR-199a/214簇的靶基因。
　　【結(jié)論】
　　miR-199a/214簇抑制 CDH1和CLDN2的轉(zhuǎn)錄后水平,下調(diào) E-cadherin和Claud