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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
通過(guò)前期lncRNA基因芯片篩選,我們尋找到了與腹膜纖維化相關(guān)的關(guān)鍵性長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(lncRNA-AV310809),共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)其可能通過(guò)纖維化信號(hào)通路(Wnt2/β-catenin信號(hào)通路)發(fā)揮作用。本研究旨在進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討該關(guān)鍵性lncRNA在腹膜纖維化過(guò)程中的作用及具體調(diào)控機(jī)制。
方法:
1、體外培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞系(HMrSV5),運(yùn)用濃度為7ng/ml的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(T
2、GF-β1)刺激細(xì)胞48h,建立腹膜間皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)模型。運(yùn)用Western blot檢測(cè)纖維連接蛋白(FN)、I型膠原蛋白(COL-I)、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)變化;運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證 lncRNA-AV310809表達(dá)水平的改變;通過(guò) Western blot觀察 TGF-β1對(duì)Wnt2/β-catenin信號(hào)通路的影響。2、運(yùn)用TGF-β1刺激已轉(zhuǎn)染lncRNA-AV
3、310809過(guò)表達(dá)質(zhì)粒或陰性對(duì)照質(zhì)粒的HMrSV5細(xì)胞。用光鏡觀察HMrSV5細(xì)胞形態(tài)的變化;Western blot及免疫熒光檢測(cè)FN、COL-I、E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá)變化以及對(duì)Wnt2/β-catenin信號(hào)通路的影響。3、運(yùn)用MTT及劃痕損傷實(shí)驗(yàn)觀察lncRNA-AV310809對(duì)HMrSV5細(xì)胞增殖及遷移的影響。
結(jié)果:
1、TGF-β1可誘導(dǎo)HMrSV5細(xì)胞EMT發(fā)生,即上皮表型E-ca
4、dherin蛋白表達(dá)水平降低,而間質(zhì)表型FN、COL-I及α-SMA蛋白表達(dá)水平升高;2、TGF-β1在誘導(dǎo)HMrSV5細(xì)胞發(fā)生EMT的同時(shí)上調(diào)了lncRNA-AV310809的表達(dá)水平(差異倍數(shù)1.30倍,P=0.02);3、TGF-β1在誘導(dǎo)HMrSV5細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程中Wnt2/β-catenin信號(hào)通路被活化(Wnt2、β-catenin蛋白表達(dá)增加);4、過(guò)表達(dá)lncRNA-AV310809可能通過(guò) Wnt2/β-cate
5、nin信號(hào)通路作用于 TGF-β1誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞 EMT發(fā)生:○1過(guò)表達(dá) lncRNA-AV310809促進(jìn)了 TGF-β1誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞梭形樣形態(tài)改變;○2過(guò)表達(dá)lncRNA-AV310809促進(jìn)了TGF-β1誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)減少,而FN、COL-I及α-SMA蛋白表達(dá)增加;○3過(guò)表達(dá)lncRNA-AV310809促進(jìn)了TGF-β1誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞Wnt2、β-catenin蛋白
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