鋅和鋅轉(zhuǎn)運體對大鼠腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響及機制.pdf

1、前言:
　　 腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)的主要替代方式之一。與血液透析相比，其具有費用相對較低、有較佳的血流動力學(xué)穩(wěn)定性、能延緩殘余腎功能下降速度、較好的清除中分子物質(zhì)、對生活方式的影響較小等優(yōu)點而被更多的ESRD患者所接受。然而，在長期腹膜透析過程中，腹膜長期與非生理性的含糖腹透液持續(xù)接觸，以及反復(fù)發(fā)生的腹膜炎等諸多因素最終

2、可導(dǎo)致腹膜纖維化(Peritoeneal Fibrosis，PF)的發(fā)生，臨床上出現(xiàn)超濾失敗成為長期腹膜透析患者退出的主要原因。因此探討PF的發(fā)生發(fā)展機制、并尋找有效的防治措施具有重要的科學(xué)意義和臨床使用價值。
　　 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，以高糖(high glucose，HG)成分為主的腹膜透析液可以導(dǎo)致腹膜間皮細胞(Rat peritoneal mesothelial cell，RPMCs)發(fā)生向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化(epith

3、elial-to-mesenchymal transition, EMT)。EMT是腹膜發(fā)生纖維化的眾多環(huán)節(jié)中的起始環(huán)節(jié)和可逆階段。因此，臨床上對EMT的防治可能會延緩腹膜纖維化的進程。其主要特征是失去上皮細胞的特性并獲得成纖維細胞合成細胞外基質(zhì)(extracellular matrix components，ECM)的特性。關(guān)鍵步驟包括上皮細胞粘附連接的丟失;細胞骨架的重組;以及基底膜的瓦解和細胞遷移、侵襲的增強。發(fā)生轉(zhuǎn)分化的腹膜間皮

4、細胞具有肌成纖維母細胞的特性，其遷移能力和侵襲性顯著增強，并且分泌多種細胞因子，從而在腹膜纖維化及血管增生中發(fā)揮作用。因此，腹膜間皮細胞的EMT是腹膜透析患者腹膜功能逐漸降低、纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。
　　 鋅是機體內(nèi)除鐵以外含量最高的過渡元素，在細胞生物中起著穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、催化和調(diào)節(jié)的作用，是人體內(nèi)300多種酶和轉(zhuǎn)錄因子的重要組成成分，直接參與了核酸、蛋白質(zhì)的合成、細胞的分化和增殖以及許多重要細胞代謝過程。鋅缺乏會引發(fā)機體發(fā)育遲緩、

5、厭食、皮膚損壞、骨骼畸形、免疫力低下等癥狀。因此，鋅離子代謝的穩(wěn)態(tài)平衡對維持機體正常生理功能至關(guān)重要。文獻證實，終末期腎臟病患者，其中包括血液透析和腹膜透析的患者均存在不同程度的鋅缺乏。以往研究證實，鋅補充能夠抑制或減輕一些動物模型的纖維化和臨床上的慢性炎癥疾病，例如:肝纖維化、心肌纖維化、血管纖維化以及系統(tǒng)性纖維化等。鋅還可以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激反應(yīng)是EMT的發(fā)生和發(fā)展的主要機制之一。相反，鋅缺乏能夠破壞上皮細胞膜完整性和功能

6、，影響膠原蛋白的合成等加重或?qū)е吕w維化。
　　 鋅離子不能自由通過細胞膜，特定的轉(zhuǎn)運蛋白和膜通道參與鋅的轉(zhuǎn)運和代謝。在維持鋅穩(wěn)態(tài)的蛋白家族中，鋅轉(zhuǎn)運體(ZnTs)特別重要。ZnT1-7是金屬離子運載體陽離子擴散促進者(CDF)家族的成員，其作用是將鋅轉(zhuǎn)運出細胞或傳遞到細胞器內(nèi)。越來越多的證據(jù)表明ZnTs不僅直接參與了細胞的鋅離子穩(wěn)態(tài)代謝，同時還通過復(fù)雜的機制影響著腫瘤和慢性炎癥性疾病等疾病的發(fā)生和發(fā)展。近期的研究證實，特定鋅轉(zhuǎn)運

7、體基因的表達在調(diào)節(jié)鋅離子介導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下大鼠肺上皮細胞、肝臟細胞膜功能障礙的細胞保護作用中起到非常重要的作用。
　　 本實驗旨在研究鋅離子及ZnTs介導(dǎo)的鋅離子轉(zhuǎn)運對HG誘導(dǎo)的RPMCs的EMT的影響，并進一步探求其影響的相關(guān)機制。本研究將為明確鋅離子在腹膜透析液中的應(yīng)用以及腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化中的作用和相關(guān)機制，尋找有效干預(yù)腹膜纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與分子靶點提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 采用HG誘

8、導(dǎo)RPMCs制備的EMT體外模型，瞬時轉(zhuǎn)染hZnT-7，ZnT7 siRNA基因的RPMCs為研究對象，應(yīng)用原子吸收光譜方法檢測各組細胞內(nèi)鋅含量的變化，應(yīng)用免疫熒光和Western Blot技術(shù)檢測EMT指標的表達變化，應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)檢測基礎(chǔ)和HG刺激后的RPMCs內(nèi)ZnTs的表達變化，應(yīng)用RNAi技術(shù)阻抑ZnT7基因和瞬時轉(zhuǎn)染hZnT-7過表達ZnT7基因在RPMCS的表達，并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測RNAi對ZnT

9、7的基因沉默效果和hZnT-7過表達的效果，采用Western Blot技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、ELISA技術(shù)、MTT等技術(shù)檢測鋅離子及ZnT7對HG誘導(dǎo)的RPMCS的EMT的影響及相關(guān)機制。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、HG對細胞活力的影響
　　 MTT結(jié)果顯示，HG處理RPMCs后，細胞活力逐漸降低，具有劑量依賴性和時間依賴性的特點。
　　 2、鋅離子對HG作用下細胞活力的影響
　　 MTT結(jié)果顯

10、示，HG處理RPMCs后，細胞活力逐漸降低，具有劑量依賴性和時間依賴性的特點，而加入10μmZnSO4細胞活力升高。
　　 3、鋅離子對HG誘導(dǎo)的EMT的表達的影響
　　 HG刺激RPMCs導(dǎo)致α-SMA、CollagenⅠ表達增加，E-cadherin表達減少，RPMCs向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化，而鋅螯合劑導(dǎo)致α-SMA、CollagenⅠ表達進一步增加，E-cadherin表達明顯減少。加入ZnSO4后，發(fā)現(xiàn)α-SMA、

11、CollagenⅠ表達降低，E-cadherin表達增多。
　　 4、鋅離子對HG誘導(dǎo)的TGF-β1分泌及ROS的表達的影響
　　 HG刺激RPMCs導(dǎo)致TGF-β1分泌及ROS的表達增加，而鋅螯合導(dǎo)致其表達進一步增加。加入ZnSO4后，發(fā)現(xiàn)TGF-β1分泌及ROS的表達下降。
　　 5、鋅離子對HG誘導(dǎo)的MAPK、NF-κB、TGF-β/Smad信號通路的影響
　　 HG刺激RPMCs導(dǎo)致MAPK、NF

12、-κB及TGF-β/Smad信號通路的激活，加入ZnSO4后，發(fā)現(xiàn)MAPK、TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵蛋白表達下調(diào)。
　　 6、ZnTs在正常和HG作用下的體外培養(yǎng)的RPMCs的表達變化
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示，正常RPMCs存在ZnT1-7的表達，HG刺激后ZnT7基因和蛋白的表達明顯升高。
　　 7、RNAi對ZnT7基因的沉默效果
　　 RT-PCR結(jié)果顯示，RNAi可在mR

13、NA水平明顯抑制RPMCs的ZnT7表達，干擾后24 h即可出現(xiàn)ZnT7的表達下降，干擾后48 h為抑制效果最佳時間點，ZnT7表達量僅為對照組的24％。
　　 8、hZnT-7-pcDNA3.1/myc-hisA對ZnT7基因過表達效果
　　 RT-PCR結(jié)果顯示，hZnT-7-pcDNA3.1/myc-hisA可在mRNA水平明顯升高RPMCs的ZnT7表達，轉(zhuǎn)染后24h即可出現(xiàn)ZnT7的表達升高，轉(zhuǎn)染后48 h為過

14、表達效果最佳時間點。
　　 9、ZnT7過表達和基因沉默對細胞活力的影響
　　 MTT結(jié)果顯示，單純ZnT7-RNAi和ZnT7過表達對細胞活力沒有明顯影響，在126mM HG處理的情況下，ZnT7過表達可提高RPMCS活力17.5％，而ZnT7-RNAi可降低大鼠腹膜間皮細胞活力10.5％。
　　 10、ZnT7過表達和基因沉默對細胞鋅轉(zhuǎn)運的影響
　　 Zinquin熒光染色結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下觀察，

15、可見鋅離子在ZnT7-RNAi組細胞核周圍的聚集明顯低于對照組細胞，而在hZnT-7轉(zhuǎn)染組細胞核周圍的聚集明顯高于對照組細胞
　　 11、ZnT7過表達和基因沉默對EMT標記蛋白(α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin)表達的Westren-blot分析
　　 單純ZnT7基因沉默和過表達后α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin的表達無明顯變化，而在HG刺激后，ZnT7-RNAi導(dǎo)致α-SMA

16、、CollagenⅠ表達升高，F(xiàn)-cadherin表達降低，而轉(zhuǎn)染hZnT-7則α-SMA、CollagenⅠ表達降低，E-cadherin表達增多。
　　 12、ZnT7過表達和基因沉默對TGF-β1分泌及TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵蛋白表達的分析
　　 Elisa結(jié)果顯示，ZnT7-RNAi干擾48 h后，予以HG作用48h，RPMCs培養(yǎng)液內(nèi)的TGF-β1蛋白含量，TGF-β/Smad信號通路的關(guān)鍵蛋白p-sm

17、ad3和p-smad4蛋白表達較對照組和HG組明顯升高，而hZnT-7轉(zhuǎn)染/HG組的TGF-β1蛋白含量，p-smad3和p-smad4蛋白表達較對照組和HG組明顯降低。
　　 13、統(tǒng)計分析
　　 數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標準誤表示，采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，各組間比較采用單因素方差分析，樣本均數(shù)間的兩兩比較采用Tukey's檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)論:
　　 1、鋅補充可阻

18、抑HG誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化，而鋅缺乏可促進HG誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化。
　　 2、鋅離子抑制HG誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化的機制是:
　　 ①鋅可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及關(guān)鍵纖維化因子的過表達而抑制大鼠腹膜間皮細胞的的轉(zhuǎn)分化。
　　 ②鋅可通過抑制MAPK、 TGF-β/Smad和NF-κB信號通路的活化而抑制大鼠腹膜間皮細胞的的轉(zhuǎn)分化。
　　 3、大鼠腹膜間皮細胞存在ZnT1-7的表達，Z