丙酸睪丸酮對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)行為及多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響.pdf

1、多巴胺(Dopamine，DA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)與神經(jīng)精神疾病關(guān)系密切的一種神經(jīng)遞質(zhì)，主要存在于黑質(zhì)紋狀體系；多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(Dopamine transporter，DAT)則是位于多巴胺能神經(jīng)末梢突觸前膜的一種膜蛋白，它特異性的再攝取DA入突觸前末梢，而終止其對(duì)突觸后神經(jīng)元的作用，是反映多巴胺能神經(jīng)體系功能狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，已廣泛用于神經(jīng)配基顯像技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)疾病腦內(nèi)是否存在多巴胺能神經(jīng)體系的障礙。 諸多研究顯示注意缺陷多動(dòng)

2、障礙(Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder，ADHD)大多在兒童和青少年時(shí)期發(fā)病，主要表現(xiàn)為注意力分散、活動(dòng)過(guò)多等癥狀。男性患者明顯多于女性，推測(cè)其發(fā)病可能與體內(nèi)雄激素水平紊亂有關(guān)。神經(jīng)顯像技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ADHD患者存在腦內(nèi)DAT結(jié)合信號(hào)的改變，可能雄激素水平的紊亂改變了腦內(nèi)DAT的表達(dá)。 近年的研究表明，雄性甾類激素(anabolic-androgenic steroids,AAS)

3、可以影響腦內(nèi)的獎(jiǎng)賞系統(tǒng)，對(duì)成年大鼠施予雄激素后，以β-CIT配基顯像技術(shù)(PET或SPECT)檢測(cè)到大鼠腦內(nèi)存在β-CIT結(jié)合信號(hào)的變化。B-CIT是目前用于檢測(cè)活體腦內(nèi)DAT常用的配基，然而B-CIT除結(jié)合DAT外，還能結(jié)合腦內(nèi)其它單胺能轉(zhuǎn)運(yùn)體如5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體。研究證實(shí)腦內(nèi)大部分區(qū)域都有三種轉(zhuǎn)運(yùn)體的交織分布。因而，應(yīng)用β-CIT配基顯像技術(shù)難以判斷DAT在腦內(nèi)的真實(shí)改變。目的：本研究利用開(kāi)放廣場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、免疫組織化學(xué)

4、技術(shù)以及Western blot方法，觀察丙酸睪丸酮早期處理大鼠行為和黑質(zhì)-尾殼核DAT免疫反應(yīng)強(qiáng)度的變化，探討丙酸睪丸酮早期處理對(duì)大鼠行為和DAT表達(dá)的影響，藉以推測(cè)兩者之間的相互關(guān)系，以期為ADHD發(fā)病的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：選用健康雄性Wistar乳鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組(testosterone propionate,TP)乳鼠自生后7d至21d，背部皮下注射丙酸睪丸酮(500μg/d)；對(duì)

5、照組(vehicle,Veh)乳鼠相同部位注射等體積芝麻油。在生后46d，和47d以開(kāi)放廣場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察大鼠運(yùn)動(dòng)行為變化，隨后以免疫細(xì)胞化學(xué)、western blot技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠腦內(nèi)DAT在腦內(nèi)的表達(dá)改變。 結(jié)果：1.開(kāi)放廣場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：在所觀察指標(biāo)中，丙酸睪丸酮處理組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)及運(yùn)動(dòng)總徑長(zhǎng)在8min組和15min組的檢測(cè)中其得分或長(zhǎng)度較對(duì)照組有顯著性差異(p＜0.05)；垂直運(yùn)動(dòng)得分在8min組第二天無(wú)意義(p＞0.05)，但存

6、在增多的趨勢(shì)，在15min組三天都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；清潔動(dòng)作次數(shù)在8min組第一天無(wú)顯著差別(p＞0.05)，但存在增多的趨勢(shì)，在15min組三天都具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。此外，在成長(zhǎng)期間，各組間體重?zé)o明顯差別，但丙酸睪丸酮處理組大鼠在開(kāi)放廣場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察中行進(jìn)路線較對(duì)照組復(fù)雜，對(duì)周圍環(huán)境的警惕性相對(duì)增高。 2.免疫組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：①DAT(抗DAT單克隆抗體)免疫反應(yīng)強(qiáng)標(biāo)記信號(hào)主要分布在中腦黑質(zhì)和尾殼

7、核。早期丙酸睪丸酮處理大鼠可提高DAT在中腦黑質(zhì)和尾殼核表達(dá)強(qiáng)度，通過(guò)靜態(tài)灰度值分析發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組黑質(zhì)101.41±4.72，對(duì)照組黑質(zhì)111.01±12.14；實(shí)驗(yàn)組尾殼核102.61±5.73，對(duì)照組尾殼核113.68±12.08，丙酸睪丸酮處理組大鼠的DAT灰度值明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，在黑質(zhì)和尾殼核分別降低了9.47％和10.79％。具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②TH免疫組化結(jié)果：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目無(wú)明顯差別(

8、P＞0.05)。黑質(zhì)和紋狀體TH免疫反應(yīng)的靜態(tài)灰度值分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的灰度值明顯低于對(duì)照組，分別降低了13.46％和14.15％(P＜0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.Western blot結(jié)果： Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，丙酸睪丸酮處理組各指標(biāo)與β-actin條帶相對(duì)吸光度比值明顯升高。(1)DAT(抗DAT單克隆抗體)與β-actin條帶相對(duì)吸光度值的比值在對(duì)照組大鼠分別黑質(zhì)0.7044±0.0734

9、(80kDa)和0.4179±0.041(50kDa)，尾殼核4.2416±0.5436(80kDa)和1.0976±0.3659(50kDa)：丙酸睪丸酮處理組大鼠為：黑質(zhì)0.9081±0.0199(80kDa)和0.5374±0.0567(50kDa)，尾殼核5.4952±0.6285(80kDa)和1.5117±0.1134(50kDa)。實(shí)驗(yàn)組大鼠80kDa和50kDa處DAT在黑質(zhì)和尾殼核的相對(duì)吸光度比值較對(duì)照組升高(P＜0.

10、05)，在黑質(zhì)增高了28.9％(80kDa)和28.6％(50kDa)，尾殼核增高了29.6％(80kDa)和37.7％(50kDa)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)DAT(兔抗DAT多克隆抗體)與β-actin條帶相對(duì)吸光度值的比值在對(duì)照組大鼠分別黑質(zhì)1.0297±0.4702(80kDa)和0.4377±0.1389(50kDa)，尾殼核0.5227±0.3035(80kDa)和0.2148±0.0898(50kDa)；丙酸睪丸酮處理組大鼠

11、為：黑質(zhì)2.5606±0.8808(80kDa)和0.7371±0.1302(50kDa)，尾殼核1.1914±0.232(80kDa)和0.4352±0.0938(50kDa)。實(shí)驗(yàn)組大鼠80kDa和50kDa處DAT在黑質(zhì)和尾殼核的相對(duì)吸光度比值較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)TH與β-actin條帶相對(duì)吸光度值的比值在對(duì)照組大鼠分別為：黑質(zhì)1.4604±0.2174、尾殼核2.6931±0.

12、2523；丙酸睪丸酮處理組大鼠為：黑質(zhì)1.9263±0.1647、尾殼核4.2186±0.3987。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組各個(gè)腦區(qū)TH與β-actin的比值增高(P＜0.05)，在黑質(zhì)和尾殼核分別增高了31.9％和56.7％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1.早期丙酸睪丸酮的處理改變大鼠青春期的運(yùn)動(dòng)行為，主要表現(xiàn)為水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)、總徑長(zhǎng)和清潔動(dòng)作次數(shù)的增多；2.早期丙酸睪丸酮的處理增加大鼠黑質(zhì)-尾殼核DAT的含量；3.早期丙酸睪丸酮的處理