JNK在腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及其對Smad通路的影響.pdf

1、腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是治療終末期腎衰竭患者的主要替代治療方式之一。與血液透析(hemodialysis，HD)相比，PD作為終末期腎臟病一體化治療的初始選擇有很多優(yōu)點，包括費用相對較低、能延緩殘余腎功能下降速度、較好的清除中分子物質(zhì)、有較佳的血流動力學(xué)穩(wěn)定性、對生活方式的影響較小等。然而，在長期腹膜透析過程中，腹膜與非生理性的含糖腹透液持續(xù)接觸，以及反復(fù)發(fā)生的腹膜炎等因素最終可導(dǎo)致腹膜纖維化(Peri

2、toeneal Fibrosis，PF)的發(fā)生，臨床上出現(xiàn)超濾失敗。這是患者退出腹膜透析的主要原因之一，同時也制約了腹膜透析的應(yīng)用和發(fā)展。 目前，腹膜纖維化發(fā)生的具體機(jī)制仍不十分清楚，防治的措施也十分有限，因此探討腹膜纖維化的發(fā)病機(jī)制，并尋求有效的防治方法，具有重要的臨床意義。 許多研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)在腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中起到關(guān)鍵的作

3、用，參與了腹膜纖維化的啟動和進(jìn)展。而TGF-β1主要是通過Smad信號蛋白來實現(xiàn)信號的胞內(nèi)傳遞。已有許多文獻(xiàn)報道Smad信號蛋白在各器官的纖維化中發(fā)揮著重要的作用，如腎、肝、肺、心等。 除了Smad通路之外，JNK(c-Jun氨基末端激酶)通路可能也參與了TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程。JNK又稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated MAPkinases，SAPK)，屬于MAPK(mitogen-activated

4、 protein kinase)中的一種。多種刺激信號如細(xì)胞因子、生長因子和環(huán)境應(yīng)激等可以介導(dǎo)JNK的活化。許多研究表明JNK信號通路在多種生命過程中起重要作用，如細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激和基因表達(dá)等。有研究認(rèn)為，在TGF-β1誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄過程中，JNK和Smad信號之間存在相互作用。且體內(nèi)及體外實驗均證實TGF-β1和其他細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)JNK對Smad2/3的磷酸化。然而，在大鼠腹膜間皮細(xì)胞(rat peritoneal meso

5、thelial cells，RPMCs)，JNK能否被TGF-β1激活，JNK是否在TGF-β1誘導(dǎo)EMT中發(fā)揮一定的作用，以及JNK對Smad信號通路有何影響，兩者之間是否存在交叉對話等，目前仍不清楚。 本研究的目的是探討JNK在TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用，及JNK與Smad信號蛋白之間的相互作用，進(jìn)而探討腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子機(jī)制，為臨床防治腹膜纖維化提供實驗依據(jù)。本研究的主要內(nèi)容包括： 1.T

6、GF-β1對大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。 2.TGF-β1對大鼠腹膜問皮細(xì)胞JNK、Smad2及Smad3磷酸化的影響。 3.JNK特異性抑制劑對TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞JNK、Smad2及Smad3磷酸化的影響。 4.JNK特異性抑制劑對TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。 5.TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中JNK與Smad3之間的相互作用。 目的：觀察JNK特異性

7、抑制劑(SP600125)對TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響方法：采用腹腔注射胰蛋白酶法，分離培養(yǎng)RPMCs，常規(guī)傳代、鑒定，取第二代腹腔間皮細(xì)胞用于實驗研究。應(yīng)用JNK特異性抑制劑(SP600125，10uM)預(yù)處理細(xì)胞4h后，加入TGF-β1(10ng/ml)刺激24h、48h收集細(xì)胞。將RPMCs分成四組：A：無血清對照組；B：TGF-β1(10ng/ml)刺激組；C-TGF-β1(10ng/ml)+SP600125(

8、10uM)組；D：SP600125(10uM)組。RT-PCR檢測α-SMA、E-cadherin、CollagenI、MMP2 mRNA表達(dá)，Western blotting檢測α-SMA、E-cadherin、Collagen1、MMP2蛋白表達(dá)，間接免疫熒光檢測α-SMA、E-cadherin、Collagen I蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和分布。結(jié)果：TGF-β1刺激組與對照組比較，α-SMA、Collagen I、MMP2 mRNA和

9、蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P均<0.05)，加入SP600125能明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA、Collagen I、MMP2 mRNA和蛋白的高表達(dá)，對E-cadherin mRNA和蛋白的下調(diào)表達(dá)也具有抑制作用(P均<0.05)；與對照組比較，單純加入SP600125對細(xì)胞各指標(biāo)的表達(dá)無明顯影響；間接免疫熒光結(jié)果表明，TGF-β1刺激RPMCs 48h，胞內(nèi)α-SMA、Collage

10、n I表達(dá)明顯增多，E-cadherin表達(dá)明顯減少，SP600125對上述指標(biāo)表達(dá)水平的變化有明顯的抑制作用。 小結(jié)：JNK特異性抑制劑可以顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)。 目的：觀察TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中JNK與Smad3之間的交叉對話。 方法：利用PCR定點突變法構(gòu)建Smad3C末端磷酸化位點突變質(zhì)粒(Smad3M)，并測序鑒定。采用腹腔注射胰蛋白酶法，分離培養(yǎng)

11、RPMCs，常規(guī)傳代、鑒定，取第二代腹腔間皮細(xì)胞用于實驗研究。TGF-β1(10ng/ml)經(jīng)不同時間(0 min、5min、10min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h、48h)刺激RPMCs后收集細(xì)胞。應(yīng)用Lipofectmine2000將pcDNA3空載體質(zhì)粒、pcDNA3-Smad3M重組質(zhì)粒或pEGFP-C1質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染RPMCs。轉(zhuǎn)染Smad3突變質(zhì)粒(1ug/ml)時，細(xì)胞分組如下：A:

12、pcDNA3空載體轉(zhuǎn)染組；B：pcDNA3空載體轉(zhuǎn)染+TGF-β1(10ng/ml)組；C：pcDNA3-Smad3M轉(zhuǎn)染組；D：pcDNA3-Smad3M轉(zhuǎn)染+TGF-β1(10ng/ml)組。應(yīng)用人胚腎293細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，擴(kuò)增攜帶有Dominant-Negative JNK1基因的重組腺病毒(Ad-DN-JNK1)，并用CsCL超速離心法對其進(jìn)行純化，純化后用Ad-DN-JNK1感染RPMCs。分組如下：A：無血清對照組；B：A

13、d-DN-JNK1感染組；C：TGF-β1(10ng/ml)+腺病毒空載體組；D：TGF-β1(10ng/mL)+Ad-DN-JNK1感染組。Western blotting 檢測p-JNK、p-Smad2和P-Smad3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：基因測序結(jié)果顯示Smad3C末端磷酸化位點缺失，Smad3突變質(zhì)粒(Smad3M)構(gòu)建成功。Smad3M按不同濃度(0、0.5、0.75、1、2 μg/ml)轉(zhuǎn)染RPMCs，Smad3M蛋白表達(dá)逐漸

14、增高，濃度為1 μg/ml時最明顯。TGF-β1刺激RPMCs 0～48h，JNK出現(xiàn)兩個活化高峰，第一個高峰在10min(與第二章相同)，第二個高峰出現(xiàn)在12h。轉(zhuǎn)染Smad3M質(zhì)粒后，不能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的JNK10min活化，但可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的JNK 12h活化。細(xì)胞感染Ad-DN-JNK1后，可以抑制Smad3的磷酸化活化(與JNK特異性抑制劑效果相似)。 小結(jié)：1.通過轉(zhuǎn)染Smad3M質(zhì)粒不能抑制TGF-

15、β1誘導(dǎo)的JNK第一個活化高峰(10min)，但可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的第二個活化高峰(12h)；2.RPMCs感染Ad-DN-JNK1后，可以抑制Smad3的磷酸化活化。表明JNK與Smad3之間存在相互激活作用：TGF-β1刺激RPMCs后首先誘導(dǎo)JNK迅速活化(5～10min)，結(jié)果促進(jìn)了Smad3的磷酸化活化(30min)，活化的Smad3又可以促進(jìn)JNK出現(xiàn)第二次激活(8～16h)。 1.TGF-β1能夠誘導(dǎo)大鼠腹膜

16、間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)。 2.TGF-β1刺激大鼠腹膜間皮細(xì)胞導(dǎo)致JNK、Smad2及Smad3磷酸化活化，JNK的活化高峰早于Smad2和Smad3。 3.JNK特異性抑制劑(SP600125)對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞p-Smad3高表達(dá)有抑制作用，但對p-Smad2高表達(dá)無明顯影響。 4.JNK特異性抑制劑(SP600125)可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)。