BMP-Smad信號通路的調(diào)節(jié)及其在成骨分化中的作用.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的一員，最早在1960s從礦化的骨骼中提取出來，并發(fā)現(xiàn)其能夠誘導(dǎo)異位骨的生長。BMPs是分泌型蛋白，存在于細(xì)胞外，并且可以在血清中檢測到。細(xì)胞外的BMPs與細(xì)胞膜上的BMP受體(BMPR)結(jié)合后導(dǎo)致受體激酶的激活，活化的受體會磷酸化細(xì)胞內(nèi)的Smad1/5/8，其

2、與Smad4形成復(fù)合物后進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到DNA序列上，從而調(diào)節(jié)BMP靶基因的轉(zhuǎn)錄。BMP-Smad信號通路受到多種機(jī)制的精細(xì)調(diào)節(jié)，尤其是受到一些負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，如受體的內(nèi)吞，Smad1的去磷酸化和信號分子的降解等。
　　 BMP-Smad信號通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和分化，細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，以及胚胎發(fā)育和出生后組織體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。BMP-Smad信號通路在腫瘤發(fā)生中也起著十分重要的作用。人和小鼠的遺傳學(xué)研究已證明BM

3、Ps在成骨的增殖、分化和骨的形成中起著重要作用。BMP-Smad信號通路的缺失會導(dǎo)致骨相關(guān)疾病，如骨質(zhì)疏松癥。而我們在對DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，在DNA損傷和腫瘤發(fā)生中起重要作用的兩個基因，毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)突變基因（ataxia-telangiectasia mutated gene，ATM基因）和p53基因可能參與了成骨的分化。我們發(fā)現(xiàn)p53敲除小鼠和Atm敲除小鼠的成骨分化功能都受到了影響，p53敲除的小鼠表現(xiàn)為骨硬化癥

4、，而Atm敲除的小鼠表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松癥，但是p53和ATM是如何調(diào)節(jié)成骨分化的，卻不是很清楚。
　　 本研究是山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室與上海交通大學(xué)Bio-X研究院的合作研究項目，旨在研究BMP-Smad信號通路的一種新型調(diào)節(jié)方式以及BMP-Smad信號通路在p53-/-和Atm-/-小鼠骨代謝和成骨分化中的作用，并進(jìn)一步研究闡明其作用機(jī)制，為骨相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。本研究分四個部分進(jìn)行:
　　 一、

5、血清饑餓對Smad1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用
　　 在長期利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)研究BMP-Smad激活的過程中，在加入BMPs處理之前，一般會先去除培養(yǎng)基中的血清進(jìn)行血清饑餓。出乎意料的是，血清饑餓后Smad1蛋白的表達(dá)會發(fā)生上調(diào)。經(jīng)過多種細(xì)胞系驗證，我們發(fā)現(xiàn)血清饑餓導(dǎo)致Smad1增加是一種普遍現(xiàn)象，因此我們認(rèn)為血清中可能存在著某種調(diào)節(jié)Smad1表達(dá)的物質(zhì)。本研究通過We

6、sternBlot證明BMP抑制劑Noggin可影響Smad1的表達(dá)，提示是血清中存在的BMPs可能調(diào)節(jié)Smad1表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的MEF細(xì)胞中，降低培養(yǎng)基中的血清水平，加入BMP抑制劑Noggin或者轉(zhuǎn)染Smad1的蛋白磷酸酶PPM1A都會導(dǎo)致Smad1蛋白水平的上調(diào)。采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測Smad1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Smad1主要定位在核周區(qū)域。進(jìn)一步采用細(xì)胞核質(zhì)蛋白分離實驗證明，在血清饑餓作用下，Smad1在細(xì)胞質(zhì)

7、的表達(dá)增加。
　　 在DNA損傷作用下，Smad1在蛋白水平的上調(diào)對于正確誘導(dǎo)p53及抑制腫瘤發(fā)生是十分重要的。由此我們推測血清饑餓導(dǎo)致Smad1上調(diào)對于機(jī)體是十分重要的，因此我們進(jìn)一步研究了Smad1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制。首先，在COS7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Smurfl，作為Smad1的E3泛素連接酶，正常情況下Smurfl會使Smad1發(fā)生降解，但是血清饑餓后對Smad1的表達(dá)卻沒有明顯作用。其次，加入蛋白合成抑制劑放線菌酮后，分析Smad

8、1蛋白的降解情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制BMP2會使Smad1蛋白穩(wěn)定性增加，并導(dǎo)致Smad1蛋白水平的上升。最后，為了探討Smad1表達(dá)增加對細(xì)胞功能是否產(chǎn)生影響，我們采用Wst-1檢測MEFs增殖的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制BMPs作用對MEFs的增殖沒有明顯的影響。同樣，在MEF中過表達(dá)Smad1或者Smad1SXS對細(xì)胞的增殖也沒有顯著性影響。但是，通過比較正常血清培養(yǎng)和血清饑餓情況下，BMP2對Smad1激活作用，我們發(fā)現(xiàn)血清饑餓影響了Smad

9、1活化的速度和幅度，即血清饑餓組Smad1活化作用更加持久，BMPs的作用更有效。
　　 這部分實驗揭示了調(diào)節(jié)BMP-Smad信號通路一個全新的機(jī)制:去除或抑制BMPs會導(dǎo)致Smad1的穩(wěn)定和重新定位，這些改變似乎對BMP2誘導(dǎo)的Smad1再激活的動力和幅度有影響，可以使Smad1活化更加持久。由于BMPs信號的強(qiáng)度主要是被Smad1 SXS(ser-x-ser)氨基酸基序磷酸化的持久度和幅度體現(xiàn)，預(yù)測這種調(diào)節(jié)作用對于BMPs在

10、機(jī)體各方面的作用都有影響。但是對于其功能及意義還需要進(jìn)一步的探討。
　　 二、p53在成骨分化中對Smad1的調(diào)節(jié)作用
　　 BMP-Smad信號通路在成骨分化過程中起著關(guān)鍵的作用。我們發(fā)現(xiàn)p53敲除小鼠的成骨分化增強(qiáng)，我們弄清這和BMP-Smad信號通路有無關(guān)系。為此，我們體外分離了p53+/+和p53-/-成骨細(xì)胞并進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，p53-/-成骨細(xì)胞的Smad1蛋白表達(dá)明顯增加，這提示p53抑制Smad1的表

11、達(dá)。采用實時定量PCR和熒光素酶報告實驗證明，p53間接調(diào)節(jié)了Smad1轉(zhuǎn)錄。然后，考慮到p53通過靶基因p21抑制細(xì)胞周期蛋白CDKs，導(dǎo)致Rb的磷酸化下降以及E2F1的失活，從而抑制p53下游基因的轉(zhuǎn)錄。我們大膽推測:在成骨細(xì)胞中p53可能通過p21-E2F1通路抑制Smad1表達(dá)。利用Western Blot檢測了p53-/-成骨細(xì)胞中p21的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示p53-/-導(dǎo)致p21表達(dá)明顯降低。而且在p53-/-成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p

12、MSCV-p21也挽救了Smad1的蛋白和mRNA水平。熒光素酶報告實驗也證明p21抑制Smad1的啟動子活性。以上這些結(jié)果表明p53通過靶基因p21調(diào)節(jié)Smad1的轉(zhuǎn)錄。
　　 最后，使用Genomatix的MatInspector軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)在Smad1啟動子有E2F1的結(jié)合位點，利用熒光素酶報告實驗研究E2F1對Smad1啟動子活性的影響，結(jié)果顯示E2F1能明顯激活Smad1-1kb的啟動子活性。我們在小鼠成骨細(xì)胞系MC3

13、T3-E1細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞IMR90-E1A中分別做了染色質(zhì)免疫共沉淀實驗，證實了E2F1是直接結(jié)合在Smad1的啟動子上。我們進(jìn)一步在成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染E2F1質(zhì)粒，結(jié)果證明E2F1的過表達(dá)引起Smad1蛋白和mRNA水平的升高。
　　 上述的實驗結(jié)果證明了p53對Smad1表達(dá)的調(diào)節(jié)是通過p21-E2F1通路來發(fā)揮作用的。
　　 三、ATM在成骨分化中對Smad1的調(diào)節(jié)作用
　　 在DNA損傷應(yīng)答中，特別是

14、DNA雙鏈斷裂時，ATM作為p53的上游影響p53的穩(wěn)定性和活化。Atm-/-小鼠患有骨質(zhì)疏松，并伴隨成骨分化受到抑制。已有研究也證明ATM和p53都能調(diào)節(jié)成骨分化特異轉(zhuǎn)錄因子Osterix(Osx)的表達(dá)，但其調(diào)控Osx表達(dá)以及成骨分化的分子機(jī)制尚不清楚。目前也沒有研究證明DNA損傷和成骨細(xì)胞分化存在著聯(lián)系。為研究ATM調(diào)節(jié)成骨分化的分子機(jī)制，我們也檢測了ATM對成骨分化相關(guān)信號通路BMP-Smad的調(diào)節(jié)。首先體外分離Atm+/+和A

15、tm-/-成骨細(xì)胞，研究了在Atm敲除的情況下，BMP信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Atm-/-成骨細(xì)胞中Smad1蛋白表達(dá)明顯降低。由于在DNA損傷和腫瘤發(fā)生中，ATM是作為p53的上游，因此我們比較了Atm+/+和Atm-/-成骨細(xì)胞中p53和p21的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Atm-/-成骨細(xì)胞中p53和p21的蛋白表達(dá)明顯增加。已有研究報道，在一些細(xì)胞包括成骨細(xì)胞中敲除ATM刺激活性氧(reactive oxygen species

16、，ROS)增加，ROS會通過多種信號通路活化p53。因此我們推測可能是由于ROS水平增加導(dǎo)致了p53表達(dá)增加。接下來，我們在Atm-/-與Atm+/+成骨細(xì)胞中加入抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)以降低細(xì)胞中的ROS水平，然后通過Western Blot檢測p53的表達(dá)，結(jié)果顯示:NAC降低了Atm-/-與Atm+/+成骨細(xì)胞中p53的表達(dá)。這提示Atm-/-成骨細(xì)胞中p53的表達(dá)上調(diào)可能部分是

17、由于ROS的增加所導(dǎo)致的。
　　 為證明Atm-/-小鼠引起的成骨分化和骨形成缺陷是否由于p53上調(diào)所導(dǎo)致的，我們將p53+/-和Atm+/-小鼠合籠產(chǎn)生Atm-/-p53-/-小鼠，隨后對該小鼠做了骨形成實驗，結(jié)果顯示:與Atm-/-小鼠相比，Atm-/-p53-/-骨量、骨形成速率、骨形成表面積和成骨細(xì)胞的數(shù)量均明顯增加，實時定量PCR和Von Kossa染色顯示Atm-/-p53-/-成骨細(xì)胞中ALP和Osx mRNA表達(dá)

18、水平增加，骨的礦化明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果證明了Atm-/-小鼠引起的成骨分化和骨形成缺陷被p53敲除所挽救。據(jù)此我們推斷Atm-/-小鼠的成骨分化和骨形成缺陷是由于p53上調(diào)導(dǎo)致的。
　　 為研究Atm-/-細(xì)胞中Smad1表達(dá)降低是否由p53增加所導(dǎo)致的，我們比較了正常、Atm-/-、p53-/-和Atm-/-p53-/-成骨細(xì)胞中p21、Smad1等蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與Atm-/-成骨細(xì)胞相比，Atm-/-p53-/-中

19、p21的蛋白表達(dá)明顯降低，而Atm-/-p53-/-成骨細(xì)胞與p53-/-成骨細(xì)胞中Smad1的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異，這表明敲除p53能夠挽救Atm-/-成骨細(xì)胞中Smad1的表達(dá)和活化，提示ATM敲除引起Smad1表達(dá)降低是由于p53表達(dá)增加所導(dǎo)致的。
　　 本實驗結(jié)果證明Atm敲除導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松可能是由于Atm敲除導(dǎo)致了p53表達(dá)上調(diào)，從而降低了Smad1的表達(dá)和活化進(jìn)而影響了骨的形成。
　　 四、BMP-Sm

20、ad信號通路在p53-/-和Atm-/-小鼠成骨分化中的作用
　　 Atm-/-和p53-/-小鼠中Smad1的表達(dá)都受到影響，這使我們想到p53信號通路和BMP-Smad通路可能存在著某種聯(lián)系。我們在p53+/+和p53-/-成骨細(xì)胞中加入了BMP通路的拮抗劑Noggin/Chordin或者轉(zhuǎn)染Smad1 siRNA來抑制BMP-Smad信號通路，利用實時定量PCR檢測了成骨分化相關(guān)因子的表達(dá)情況，結(jié)果表明p53-/-和WT成

21、骨細(xì)胞的Osx和ALP mRNA水平都明顯降低。在p53-/-成骨細(xì)胞中過表達(dá)p21，結(jié)果證明過表達(dá)p21抑制了ALP和Osx的mRNA表達(dá)，從而抑制了成骨細(xì)胞分化。以上結(jié)果證明了我們的推測，p53敲除導(dǎo)致骨硬化癥是通過p21-E2F1導(dǎo)致Smad1表達(dá)增加所引起的。
　　 在Atm-/-成骨細(xì)胞中由于p53增加降低了Smad1的表達(dá)，而在Atm-/-p53-/-成骨細(xì)胞，由于p53的敲除挽救了Smad1的表達(dá)從而加速了成骨分化

22、。我們在Atm-/-p53-/-成骨細(xì)胞中加入Noggin/Chordin來檢測成骨細(xì)胞的分化情況，實時定量PCR和Von Kossa染色結(jié)果顯示，Noggin/Chordin明顯降低ALP和Osx的表達(dá)，抑制了骨的礦化。這表明Atm-/-p53-/-成骨細(xì)胞的分化增加是由于Smad1的表達(dá)和活化增加所導(dǎo)致的。
　　 結(jié)論:綜上所述，我們在本研究中首次發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)BMP-Smad信號通路的一種新的機(jī)制，在抑制BMP作用后，Smad

23、1表達(dá)上調(diào)并重新定位于細(xì)胞核周區(qū)域，這些改變對于Smad1的再激活有著重要的作用，但是由于在體內(nèi)的機(jī)制十分復(fù)雜，我們?nèi)匀恍枰M(jìn)一步的研究。另外，我們還發(fā)現(xiàn)了在成骨分化以及骨生成中，p53和ATM調(diào)節(jié)Smad1的表達(dá)以及成骨分化。ATM和p53在成骨分化中的作用和它們在DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)/腫瘤抑制中相互作用關(guān)系是相反的。我們的研究建立了ATM-p53和BMP-Smad兩個通路之間的關(guān)系，證明ATM-p53通過BMP-Smad調(diào)節(jié)成骨分化。