Bmp4-Smad信號通路在小鼠精原干細(xì)胞分化過程中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 及意義精原干細(xì)胞(spermatogonialstemcells，SSCs)是位于睪丸曲細(xì)精管基膜上既能自我更新維持自身群體恒定，又能定向分化，最終產(chǎn)生精子的一類成體干細(xì)胞。近年來，由于SSCs在精子發(fā)生機(jī)理研究、男性不育治療、遺傳性疾病治療、轉(zhuǎn)基因動物建立及多潛能干細(xì)胞制備等方面的重要價值，探討SSCs增殖分化的分子調(diào)控機(jī)制，成為生殖生物學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　 骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bonemor

2、phogeneticprotein-4，Bmp4）是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，TGF-β)家族中重要的一員，在胚胎發(fā)育時期，對多種細(xì)胞的增殖分化具有調(diào)控作用。Bmp4基因敲除會引起胚胎中胚層發(fā)育缺陷而導(dǎo)致小鼠胚胎性死亡。Bmp4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通常由細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad介導(dǎo)。Bmp4通過絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(TβRⅡ)結(jié)合，再與TβR-Ⅰ受體結(jié)合形成復(fù)合物。復(fù)合物形成激活了Ⅰ型受體的蛋白激酶

3、，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受體Smads蛋白（如Smad1，Smad5，Smad8）的磷酸化，激活的R-Smads與共用型(CO-Smad4)結(jié)合形成Smad蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特異的轉(zhuǎn)錄啟動子或阻遏蛋白再次結(jié)合形成復(fù)合物，最終與DNA結(jié)合，進(jìn)行特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究表明，Bmp4/Smad信號通路參與胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等干細(xì)胞的增殖分化調(diào)控。但目前尚未有人研究Bmp4/Smad信號通路在精原干細(xì)胞分化過程的作用及其作用機(jī)制。

4、r>　　 本研究利用體外培養(yǎng)的小鼠精原干細(xì)胞，通過免疫熒光染色、實時定量PCR及RNA干擾等方法，檢測了外源性Bmp4對SSCs分化的影響，以及在此過程中SSCs分化關(guān)鍵基因sohlh2和c-kit表達(dá)變化，從而探討了Bmp4/Smad信號通路在精原干細(xì)胞分化中的作用及其可能的作用機(jī)制，為將來男性不育癥治療提供了新的理論和實驗依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 1.SSCs培養(yǎng)鑒定取原代培養(yǎng)的SSCs在MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)4

5、8小時后，通過免疫熒光染色，檢測SSCs鑒定標(biāo)志物PLZF，Oct4在SSCs中的表達(dá)。
　　 2.SSCs體外處理將細(xì)胞分為三組，分別為:正常對照組（Con組），添加50ng/mLBmp4組（Bmp4組），添加50ng/mLBmp4和2μmol/LBmp4抑制劑組(Bmp4+Bmp4抑制劑組)。培養(yǎng)48小時后，通過免疫熒光，檢測Sohlh2、C-kit、Smad和PLZF在三組細(xì)胞中的表達(dá)及其變化規(guī)律。培養(yǎng)24小時后，通過實時

6、定量PCR，檢測sohlh2、c-kit、oct4和PLZF基因在三組細(xì)胞中mRNA的水平及其變化規(guī)律。
　　 3.SSCsRNA干擾將細(xì)胞分為四組，分別為:非特異性siRNA+con組，非特異性siRNA+Bmp4組，sohlh2siRNA+con組及sohlh2siRNA+Bmp4組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時，通過實時定量PCR，檢測sohlh2、c-kit、PLZF和oct4基因在四組細(xì)胞中的mRNA水平及其變化規(guī)律。

7、>　　 結(jié)果:
　　 1.形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，倒置顯微鏡下可見由十幾個細(xì)胞聚集成的克隆團(tuán)，細(xì)胞為圓形，細(xì)胞大小比較均勻，核大胞體小，核/質(zhì)比高。免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示，PLZF和Oct4在SSCs中特異表達(dá)。
　　 2.免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sohlh2、C-kit及Smad的陽性表達(dá)主要分布于SSCs克隆團(tuán)塊的周邊，PLZF的陽性表達(dá)主要分布于SSCs克隆團(tuán)塊的中心。Bmp4組Sohlh2和C-kit的陽性細(xì)胞數(shù)和

8、表達(dá)量均明顯高于Con組和Bmp4+Bmp4抑制劑組，Con組和Bmp4+Bmp4抑制劑組之間無顯著性差異;Bmp4組Smad的核內(nèi)表達(dá)明顯高于其他兩組;Con組和Bmp4+Bmp4抑制劑組PLZF的表達(dá)明顯高于Bmp4組。實時定量PCR結(jié)果顯示，與Con組相比較，Bmp4組PLZF和oct4mRNA水平明顯降低，而sohlh2及c-kitmRNA水平明顯增加，差異有顯著意義(P＜0.05);Bmp4+Bmp4抑制劑組中各基因表達(dá)與Co

9、n組無顯著差異。
　　 3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染sohlh2siRNA后，實時定量PCR結(jié)果顯示，與非特異性siRNA+Bmp4組相比較，sohlh2siRNA+Bmp4組c-kitmRNA水平明顯減少，PLZF和oct4mRNA水平明顯增加，差異有顯著差異(P＜0.05)。與非特異性siRNA+con組相比較，非特異性siRNA+Bmp4組sohlh2和c-kitmRNA水平明顯增加，PLZF和oct4mRNA水平明顯減少，差異有顯著意義