Smad串話JNK信號通路在BMP-9誘導PDLSCs成骨分化過程中作用與機制研究.pdf

1、研究目的:
　　牙周炎是影響口腔健康導致失牙的主要原因，傳統(tǒng)的治療方案僅能改善牙周環(huán)境難以修復牙周炎引起的牙槽骨缺損。牙周組織工程通過構建細胞和多種材料的復合體并移植于牙槽骨缺損處，起到重建牙周組織、治療疾病的作用。牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周膜中具有自我增殖與多向分化潛能的干細胞，運用于牙周組織工程可顯著增強牙周組織的形成和修復能力。骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone

2、 morphogenetic proteins-9，BMP9)是優(yōu)秀的成骨生長因子，已證實其具有較好的促干細胞成骨分化的能力，但對其作用機制尚不明確。有學者提出BMP9的作用機制包含Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic proteins，Smads)傳遞信號為主的BMPs-Smad經(jīng)典通路，以及通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kin

3、ases，MAPK)傳遞信號的BMPs-MAPK非經(jīng)典途徑，其中BMPs-Smad經(jīng)典通路已獲得學術界普遍認可，但對于BMPs-MAPK途徑尚處于探索和初級研究階段。MAPK通路下游底物與骨生長發(fā)育并沒有直接關系，但有研究報道部分MAPK家族成員參與BMPs促成骨分化，因此猜測MAPK是通過串話其他通路參與BMPs誘導成骨的過程。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)作為MAPK家族重要成員，尚

4、沒有在BMP9促進成骨分化的作用和機制中有研究報道。此前有學者證實JNK與Smad2/3蛋白可以發(fā)生相互作用，這為兩條通路的串話提供了前提，但是目前為止，尚未有JNK通路和Smad2/3通路在BMP9誘導PDLSCs成骨分化過程中是否發(fā)生串話以及如何發(fā)生串話的文獻報道。為了明確JNK通路是否在BMP9誘導PDLSCs成骨分化過程中發(fā)揮作用，以及JNK通路是否串話Smad信號通路，如何進行串話等問題，本項課題將深入研究討論。
　　研

5、究方法:
　　1.從牙周膜組織中通過改良組織塊貼壁法獲取離體細胞，通過CD146免疫磁珠分選獲取PDLSCs，之后進行細胞表面標志物鑒定、組織來源鑒定、成骨分化和成脂分化能力鑒定。
　　2.構建過表達Ad-BMP9載體，檢測其對PDLSCs合適的感染劑量(multiplicities of infection，MOI)后誘導PDLSCs成骨分化，檢測BMP9、Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcri

6、ption factor2，Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣蛋白(osteoclain，OCN)等成骨基因蛋白的表達情況和ALP活性等指標，分析BMP9促進PDLSCs成骨分化的能力。
　　3.通過SP600125和AdR-si-JNK抑制或干擾JNK通路，驗證干擾效果后，檢測Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白的表達情況和A

7、LP活性、鈣鹽結節(jié)沉積量等指標，判斷JNK通路是否參與BMP9誘導PDLSCs成骨分化。通過抑制或干擾JNK通路，檢測Smad2/3和p-Samd2/3的蛋白表達，判斷JNK通路是否與Smad通路有密切關系，最后通過免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）檢測p-JNK是否與Smad2/3發(fā)生反應。綜合分析后，判斷JNK通路是否串話Smad通路并在BMP9誘導PDLSCs成骨分化過程中發(fā)揮作用。
　　

8、4.向裸鼠肌肉內(nèi)移植過表達BMP9的PDLSCs，使用腺病毒干擾JNK通路，通過影像學和HE染色對比未干擾JNK通路裸鼠異位成骨狀態(tài)，鑒定分析JNK通路對BMP9誘導PDLSCs體內(nèi)成骨的影響。
　　研究結果和結論:
　　1.經(jīng)磁珠分選所得的細胞同時表達CD146陽性和STRO-1陽性比例約占27.9％;免疫熒光染色顯示角蛋白陰性、波形蛋白陽性，表示細胞為中胚層來源的間充質細胞，且無外胚層來源細胞的污染;茜素紅S染色和油紅O

9、檢測表明分選后細胞具有成骨和成脂的多向分化潛能。
　　2.熒光表達顯示Ad-BMP9感染PDLSCs的MOI值為30-60，感染之后BMP9基因蛋白明顯增高，表明構建的腺病毒有效;此外Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白和ALP活性均較對照組明顯增高，結果具有統(tǒng)計學意義，證明BMP9具有誘導PDLSCs成骨分化的作用。
　　3.分別抑制或干擾JNK通路后，p-JNK蛋白表達下降，證實JNK通路受到影響;干擾之后R

10、unx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白的表達情況和ALP活性、鈣鹽結節(jié)沉積量等指標均有不同程度下降，結果具有統(tǒng)計學意義，表明JNK通路參與BMP9誘導PDLSCs成骨分化;此外p-Smad的蛋白也隨著JNK通路被干擾而表達下降，證實JNK通路與Smad通路關系密切，最后通過Co-IP檢測證實p-JNK和Smad2/3存在相互作用，結果表明JNK通路是通過串話Smad通路參與BMP9誘導PDLSCs成骨分化的過程。
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