NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的TNF-α抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的作用研究.pdf

1、牙周病是口腔兩大常見(jiàn)病多發(fā)病之一，是導(dǎo)致牙齒缺失的重要原因。它是以牙周袋形成和牙槽骨吸收為特點(diǎn)的細(xì)菌感染性炎性疾病，其特征是牙周支持組織（牙槽骨，牙骨質(zhì)和牙周韌帶）的炎癥和破壞。牙周病治療的最終目的是重建因炎癥過(guò)程而破壞的牙周組織，恢復(fù)牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能，要求有新的牙槽骨和牙骨質(zhì)及插入其中的膠原纖維的形成，即真正意義上的再生。而真正意義上的牙周再生應(yīng)該是對(duì)發(fā)育過(guò)程中胚胎發(fā)生和形態(tài)發(fā)生的重演，其中干細(xì)胞的增殖與分化是決定牙周再生成功與否

2、的關(guān)鍵因素。干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和分化的潛能的細(xì)胞，其增殖和分化受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素影響?？谇皇莻€(gè)細(xì)菌污染環(huán)境，而牙周病更是細(xì)菌感染性疾病，在牙周再生過(guò)程中，干細(xì)胞處于炎性微環(huán)境當(dāng)中，其增殖和分化的調(diào)控很可能受到炎性因子的影響，現(xiàn)有大多數(shù)研究以成骨細(xì)胞系為研究對(duì)象，證實(shí)炎性因子能夠影響成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)、細(xì)胞基質(zhì)的分泌以及成骨細(xì)胞的凋亡，但沒(méi)有說(shuō)明在干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中炎性信號(hào)通路對(duì)成骨基因表達(dá)的調(diào)控作用。因此，在

3、牙周病的病理和修復(fù)過(guò)程中，慢性、長(zhǎng)期、高濃度的炎性微環(huán)境對(duì)于成體干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化影響機(jī)制的研究，將有助于我們了解炎癥刺激下的成體干細(xì)胞的生物學(xué)特性，據(jù)此為臨床研發(fā)新的更有效的牙周治療方法開(kāi)辟新的思路。
　　 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB廣泛存在于真核生物中，是一個(gè)由復(fù)雜的多肽亞單位組成的蛋白家族。它作為信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的樞紐，與免疫、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)以及胚胎發(fā)育等重要事件有著密切聯(lián)系，是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB

4、在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起關(guān)鍵性的調(diào)控作用，它調(diào)控的基因編碼急性期反應(yīng)蛋白、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子、免疫調(diào)節(jié)分子、病毒瘤基因、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄和生長(zhǎng)調(diào)控因子等。通過(guò)調(diào)控多種基因的表達(dá)，NF-κB參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、成骨分化等多種生物進(jìn)程。有活性的DNA結(jié)合的經(jīng)典N(xiāo)F-κB信號(hào)是一個(gè)二聚體（p50和p65的二聚體），靜息狀態(tài)下，NF-κB以無(wú)活性的潛在狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，它與一種抑制因子IκB結(jié)合組成一個(gè)三聚體p5

5、0-p65-IκB。當(dāng)細(xì)胞受到TNF、IL-1等炎性因子刺激時(shí)，IκB即從三聚體中解離出來(lái)，暴露出p50亞基上的易位信號(hào)和p65亞基上的DNA結(jié)合位點(diǎn)，從而使此異二聚物表現(xiàn)出NF-κB活性，并從細(xì)胞質(zhì)中易位到細(xì)胞核中，與κB基序(κBmotif)相結(jié)合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。在炎癥的牙周微環(huán)境中，NF-κB在炎性因子的作用下，通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，調(diào)控著各種上下游成骨基因的表達(dá)。
　　 近年來(lái)，有研究者提出NF-κ

6、B與BMP2和Runx2這兩種成骨誘導(dǎo)因子存在相關(guān)性。骨形成蛋白BMP2不僅在體內(nèi)可以引起骨的形成，而且在體外能引起間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化，然而B(niǎo)MP2尚不能滿(mǎn)足牙周病治療中骨再生的臨床應(yīng)用，可能的原因是炎癥因子抑制了骨再生和其誘導(dǎo)的成骨分化，目前絕大多數(shù)研究者認(rèn)為T(mén)NF-α可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)BMP2的表達(dá)，而B(niǎo)MP2可通過(guò)激活Smad途徑，促進(jìn)下游成骨效應(yīng)分子表達(dá)。但也有研究表明TNF-α通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制了成骨分化。

7、這其中的確切機(jī)制的明確將有助于在炎癥狀態(tài)下骨缺損修復(fù)中成骨分化的誘導(dǎo)。
　　 在成骨分化的眾多調(diào)控因子當(dāng)中，Runx2被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化的主控基因(mastergene)，在Runx2基因敲除的小鼠中成熟的成骨細(xì)胞和骨化完全缺失，僅能觀察到一些只微弱表達(dá)ALP活性而不表達(dá)骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和骨鈣素(osteocalcin，OC)的不成熟成骨細(xì)胞。有證據(jù)顯示TNF-α可以通過(guò)抑制Runx2而抑制前成骨細(xì)胞

8、的分化，雖然確切機(jī)制尚有爭(zhēng)議，但提示炎性因子有可能通過(guò)NF-κB信號(hào)途徑在Runx2與其下游效應(yīng)分子之間起到調(diào)控作用。
　　 因此，本研究以小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞ST2為研究對(duì)象，分別過(guò)表達(dá)了NF-κB的兩個(gè)不同亞基p50/p65，以及過(guò)表達(dá)IκB以阻斷NF-κB信號(hào)通路。在體外經(jīng)礦化誘導(dǎo)，觀察過(guò)表達(dá)NF-κB是否重演了炎性因子對(duì)成骨分化的影響，阻斷NF-κB是否消除了炎性因子對(duì)各成骨信號(hào)通路的影響。施加炎癥刺激和成骨誘導(dǎo)，利用Du

9、al-Luciferase雙熒光素酶檢測(cè)BMP-Smad信號(hào)通路、Runx2-BSP、Runx2-OSE信號(hào)通路是否由TNF-α通過(guò)NF-κB信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)。
　　 材料和方法：
　　 1.TNF-α對(duì)成骨誘導(dǎo)ST2細(xì)胞成骨基因表達(dá)的影響，及其對(duì)BMP2和Runx2促成骨作用的調(diào)控
　　 復(fù)蘇凍存的ST2細(xì)胞，經(jīng)傳代后達(dá)到良好細(xì)胞狀態(tài)后，分別施以成骨誘導(dǎo)液，TNF-α或/和BMP2;TNF-α或/和過(guò)表達(dá)Runx

10、2質(zhì)粒;誘導(dǎo)一定時(shí)間段后提取總RNA或/和總蛋白，采用RT-PCR和Westernblot法觀察各成骨基因在ST2細(xì)胞中的表達(dá)，檢測(cè)TNF-α對(duì)ST2細(xì)胞成骨基因表達(dá)的影響及是否調(diào)控BMP2和Runx2對(duì)下游成骨基因的促進(jìn)作用。
　　 2.TNF-α及其下游NF-κB信號(hào)通路對(duì)BMP2-Smad信號(hào)通路的影響。
　　 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p65、p50、IκB、及其相應(yīng)對(duì)照空載體到ST2細(xì)胞中，成骨誘導(dǎo)，TNF-α和/或BMP2作用

11、后，在一定時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞并提取總RNA，用RT-PCR法檢測(cè)目的成骨基因的變化;瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染帶有Smad結(jié)合元件啟動(dòng)子的SBE-luc和Renia熒光素酶到相應(yīng)細(xì)胞中，TNF-α和/或BMP2作用后，檢測(cè)熒光報(bào)告基因表達(dá)，判斷BMP2對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄控制是否被炎性因子TNF-α或NF-κB信號(hào)通路的阻斷而影響。
　　 3.TNF-α對(duì)Runx2-BSP和Runx2-OSE信號(hào)通路的抑制是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的
　　

12、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p65、p50、IκB、及其相應(yīng)對(duì)照空載體到ST2細(xì)胞中，再共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Runx2和帶有BSP(或OSE)啟動(dòng)子的熒光報(bào)告基因和海腎熒光素酶到相應(yīng)細(xì)胞中，施以TNF-α刺激，以不加TNF-α作對(duì)照，檢測(cè)熒光值。比較TNF-α對(duì)Runx2-BSP和Runx2-OSE信號(hào)通路的抑制是否通過(guò)NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、TNF-α對(duì)ST2細(xì)胞成骨分化中BMP2和Runx2基因表達(dá)水平及其促成骨功能的影

13、響
　　 作為未成熟的前成骨細(xì)胞，ST2細(xì)胞的成骨基因的表達(dá)有時(shí)空特點(diǎn)，其中BMP2、Runx2屬于上游基因，礦化誘導(dǎo)早期就能高表達(dá)，OC，BSP屬于下游基因。在礦化誘導(dǎo)的ST2細(xì)胞中，TNF-α提高了BMP2的表達(dá)，抑制Runx2，OC，BSP的表達(dá)，可不同程度地逆轉(zhuǎn)BMP2和Runx2上調(diào)其下游靶基因OC，BSP表達(dá)水平的作用。
　　 2、TNF-a通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)BMP2的表達(dá)，但對(duì)BMP2-Smad信號(hào)

14、通路無(wú)影響
　　 成骨誘導(dǎo)的阻斷NF-κB信號(hào)通路的ST2細(xì)胞中，TNF-α對(duì)BMP2表達(dá)的促進(jìn)作用被消除;但不影響B(tài)MP2對(duì)下游基因的調(diào)控，對(duì)BMP-Smad信號(hào)通路無(wú)影響。成骨誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)NF-κB信號(hào)通路的ST2細(xì)胞中，BMP2表達(dá)水平顯著提高，再加入外源性BMP2之后，下游基因OC，BSP的表達(dá)有所提高，但不如對(duì)照組提高的幅度大;對(duì)BMP-Smad信號(hào)通路亦無(wú)影響。
　　 3、TNF-α通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)

15、Runx2-BSP通路，但對(duì)Runx2-OSE啟動(dòng)子信號(hào)通路無(wú)影響
　　 在ST2細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)p50或p65可在ST2細(xì)胞成骨分化過(guò)程中降低Runx2的表達(dá)水平;過(guò)表達(dá)IκBα阻斷NF-κB信號(hào)通路后，TNF-α抑制Runx2表達(dá)的作用被拮抗。在ST2細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)p50或p65可抑制Runx2對(duì)9.0kbBSP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用;TNF-α可抑制Runx2對(duì)9.0kbBSP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用，而通過(guò)過(guò)表達(dá)IκBα阻斷NF-κ

16、B信號(hào)通路后，TNF-α的這一抑制作用被消除。TNF-α和NF-κB信號(hào)通路均不影響Runx2對(duì)OSE2的轉(zhuǎn)錄激活作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.TNF-α上調(diào)了BMP2的mRNA表達(dá)，但其對(duì)BMP2促成骨功能的逆轉(zhuǎn)或抑制最終掩蓋了BMP2的促成骨作用，從而使得TNF-α，尤其是高濃度的TNF-α，對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化的最終作用主要表現(xiàn)為抑制。
　　 2.在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過(guò)程中，TNF-α及其激活的

17、NF-κB信號(hào)通路雖然能夠上調(diào)BMP2基因的表達(dá)水平，但是TNF-α顯著抑制BMP2下游成骨效應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。這一抑制作用不是通過(guò)以GTCTAGACSmad結(jié)合序列為特征的BMP2-Smad信號(hào)通路完成的。
　　 3.在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過(guò)程中，TNF-α及其激活的NF-κB信號(hào)通路抑制了Runx2基因的表達(dá)水平，同時(shí)通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制了Runx2激活的BSP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但是并不影響Runx2激活的OSE2啟動(dòng)