熊果酸通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制小鼠T細(xì)胞激活的研究.pdf

1、目的：熊果酸(UA)是存在于天然植物和藥物中的一種三萜類(lèi)化合物，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。許多學(xué)者研究了熊果酸的抗腫瘤、抗炎和免疫調(diào)節(jié)功效。但到目前為止熊果酸對(duì)T細(xì)胞功能的影響尚不明確。T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的主要組分，是免疫識(shí)別、應(yīng)答以及調(diào)控的主要細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)處于主導(dǎo)地位，T細(xì)胞活化在正常的免疫應(yīng)答和病理性免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵性作用。 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以多關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞，大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞

2、浸潤(rùn)為特征的一種常見(jiàn)自身免疫性疾病。RA的病理和病因包括了自身抗原的異常呈遞和自身反應(yīng)性T細(xì)胞的激活。一般認(rèn)為RA的慢性炎癥是由抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，促使T細(xì)胞向滑膜浸潤(rùn)引起炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步導(dǎo)致滑膜增生和血管翳產(chǎn)生及軟骨、骨的吸收。RA伴隨著T細(xì)胞過(guò)度增殖，關(guān)節(jié)滑膜液淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志CD69、CD25、CD71、HLA-DR表達(dá)增高，血清中Th1/Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子存在明顯失衡。雖然，RA的發(fā)病機(jī)制至今不明，但是研究淋巴細(xì)胞活化

3、及其信號(hào)傳遞異常，改變細(xì)胞信號(hào)異常傳遞，平衡促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而阻斷淋巴細(xì)胞的過(guò)度激活，將為臨床診斷和治療RA提供新的思路。因此，以小鼠體外T淋巴細(xì)胞模型為研究對(duì)象，尋找具有免疫調(diào)節(jié)作用的中藥成分，為治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病篩選有效中藥，具有一定的實(shí)際意義。 CD69，CD25，CD71在T細(xì)胞中的表達(dá)均與T細(xì)胞增殖相關(guān)。IL-2、IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2反應(yīng)的代表，檢測(cè)IL-2、I

4、FN-γ和IL-4，可反應(yīng)Th1/Th2平衡狀況。NF-κB在炎癥和自身免疫性疾病的病理機(jī)制中發(fā)揮重要的免疫學(xué)作用，從而導(dǎo)致類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)展。NF-κB活化的抑制劑可能有效治療自身免疫性和炎性疾病。 中藥復(fù)方痹腫消湯由白花蛇舌草、藤梨根、絡(luò)石藤等組成，是治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效方劑，而熊果酸是其中多種中藥的主要活性成分。先前的研究證明熊果酸具有明顯的抗炎作用，能改善膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠的癥狀，但機(jī)制并不清楚。本研究探討

5、了熊果酸體外對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖、激活、細(xì)胞因子表達(dá)以及NF-κB信號(hào)通路的影響，為熊果酸對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病和炎癥性疾病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：為了探討熊果酸的免疫調(diào)節(jié)作用，研究了體外熊果酸對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖、激活，細(xì)胞因子表達(dá)以及NF-κB信號(hào)通路的影響。首先，采用MTT法檢測(cè)熊果酸對(duì)ConA或PMA加Ion誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響；其次，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熊果酸對(duì)PMA誘導(dǎo)的T細(xì)胞表面分子CD69、CD2

6、5、CD71表達(dá)的影響；第三，采用RT-PCR方法驗(yàn)證熊果酸對(duì)PMA加Ion誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4mRNA表達(dá)的影響；第四，采用ELISA法測(cè)定熊果酸對(duì)PMA加Ion誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞分泌IL-2水平的影響。第五，采用Wersten blot方法檢測(cè)熊果酸對(duì)PMA激活T淋巴細(xì)胞IκB-α磷酸化和NF-κB P65入核的影響。 結(jié)果： (1)MTT比色法結(jié)果顯示熊果酸(5-30μ

7、M/L)能劑量依賴性地抑制ConA或PMA加Ion誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖。 (2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示熊果酸(10-30μM/L)能劑量依賴性地減少PMA激活后T細(xì)胞CD3+CD69+、CD3+CD25+、CD3+CD71+陽(yáng)性率。 (3)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示熊果酸(5-30μM/L)能劑量依賴地降低PMA加Ion誘導(dǎo)的T細(xì)胞IL-2和IFN-γ(Th1)、IL-4(Th2)mRNA表達(dá)。 (4)ELISA