姜黃素通過抑制NF-κB通路逆轉(zhuǎn)吸煙誘導(dǎo)膀胱上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、背景與研究目的：
　　膀胱癌是世界上發(fā)病率較高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中最常見的病理類型是移行上皮細(xì)胞癌，具有復(fù)發(fā)性，浸潤性和難治愈性等特點。流行病學(xué)研究已經(jīng)證實香煙暴露是膀胱癌的重要誘發(fā)因素之一，但香煙暴露與膀腫癌進展的分子機制尚未得到充分研究。研究顯示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在腫瘤細(xì)胞的進展中起到至關(guān)重要的作用。大量研究證實姜黃素對多種腫瘤細(xì)胞的生長均有抑制作

2、用。實驗著重研究香煙暴露對膀胱移行上皮細(xì)胞EMT的影響，并探討NF-κB通路在EMT中的作用及姜黃素的干預(yù)效應(yīng)。
　　方法：
　　首先通過MTT實驗篩選出對膀胱正常上皮細(xì)胞（SV-HUC-1 cells）沒有毒性的香煙懸液（cigarette smoking extract,CSE）濃度。
　　（1）觀察CSE處理對SV-HUC-1細(xì)胞形態(tài)的影響，使用顯微鏡進行拍照并記錄。
　?。?）利用細(xì)胞劃痕實驗和trans

3、well小室實驗觀察CSE處理對細(xì)胞的遷移和侵襲能力的變化，并用顯微鏡拍攝記錄。
　?。?）CSE處理后，觀察細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物蛋白及mRNA水平的變化，采用Western Blotting和qRT-PCR及免疫熒光的方法檢測。
　?。?）接著應(yīng)用Western Blotting檢測了CSE處理后細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路標(biāo)志性蛋白的變化。
　?。?）繼而用NF-κB通路特異性抑制劑觀察其對CSE誘導(dǎo)的SV-HUC-1

4、細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的逆轉(zhuǎn)效果。
　　（6）最后將CSE和姜黃素聯(lián)合處理細(xì)胞，觀察姜黃素對CSE引起的SV-HUC-1細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)作用。
　　結(jié)果：
　?。?）通過MTT檢測不同香煙懸液濃度下的細(xì)胞活性，我們發(fā)現(xiàn)1％時細(xì)胞活性下降至80%以下，存在統(tǒng)計學(xué)意義。最終選擇香煙懸液的濃度為選用0.1%,0.25%,0.5%做為實驗劑量。
　　（2）將SV-HUC-1細(xì)胞暴露于選定的香煙懸液下7天后，觀察細(xì)胞形

5、態(tài)，發(fā)現(xiàn)正常的膀胱移行上皮細(xì)胞呈現(xiàn)飽滿的圓形，橢圓形，細(xì)胞呈凝聚狀態(tài)。處理后細(xì)胞變成長梭形，形似蝌蚪狀，細(xì)胞之間較為分散。細(xì)胞劃痕實驗及 transwell小室實驗證明細(xì)胞的遷移及侵襲能力升高。
　　（3）經(jīng)香煙懸液處理7天后, Western Blotting,qRT-PCR及免疫熒光檢測細(xì)胞的標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)志物：E-Cadherin、ZO-1表達(dá)下降，間質(zhì)標(biāo)志物：vimentin、N-cadherin表達(dá)上調(diào)。
　　

6、（4）NF-κB通路激活，一定香煙懸液濃度下，隨著香煙懸液濃度增加，NF-κB特異性蛋白：p65，p50的核表達(dá)水平升高，胞質(zhì)中的磷酸化IKKα/β(phosphorylated IKKα/β)升高，而通路的抑制劑IκB持續(xù)降低。通過蛋白檢測證實當(dāng)NF-κB通路活性被抑制劑PDTC有效抑制時，香煙懸液誘導(dǎo)的SV-HUC-1細(xì)胞上皮間質(zhì)化被成功逆轉(zhuǎn)。上皮標(biāo)志物：E-Cadherin、ZO-1表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物：vimentin、N-ca

7、dherin的表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞的遷移侵襲能力被抑制。
　?。?）姜黃素通過抑制NF-κB通路活性，達(dá)到抑制香煙懸液誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的效果。通過蛋白及基因檢測，發(fā)現(xiàn)上皮蛋白表達(dá)水平上調(diào)，間質(zhì)蛋白表達(dá)水平下降。
　　結(jié)論：
　　1、香煙懸液誘導(dǎo)膀胱移行上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　2、NF-κB通路在香煙懸液引起的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中起到重要的作用，為流行病學(xué)調(diào)查起到相互印證的作用，同時為分子靶向治療提供科