MiR-200c抑制TGF-β1誘導(dǎo)氣管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型的相關(guān)研究.pdf

1、背景：
　　氣管移植是解決如原發(fā)性氣道狹窄、氣管粘膜損傷、氣管腫瘤等疾病的主要手段。而氣管移植后管腔大量纖維結(jié)締組織生成，阻塞氣管暢通，容易導(dǎo)致移植的失敗，因此制約氣管移植成功的關(guān)鍵是治療移植后氣管狹窄的問題。造成移植體狹窄病理因素主要包括：移植體過度纖維化形成的纖維瘢痕和氣管再軟骨化障礙，其機制尚不清楚。早期研究，利用緩釋骨形態(tài)發(fā)生蛋白與表皮生長因子促進(jìn)氣管再軟骨化的形成，一定得程度上解決了維持氣管正常形態(tài)的問題，可是移植體大量

2、纖維組織增生仍然未能解決。氣管移植體中成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的大量生成、排斥反應(yīng)、炎性細(xì)胞的侵潤，均是誘發(fā)氣管移植體管腔中大量纖維結(jié)締組織生成的主要原因。其中有關(guān)過度生成的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的來源主要包括，第一，是氣管上皮細(xì)胞的病理轉(zhuǎn)化；第二是骨髓干細(xì)胞的分化。氣管移植體成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞多數(shù)由氣管上皮細(xì)胞受病理刺激后轉(zhuǎn)化而來，由骨髓干細(xì)胞分化而來的較少。上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal t

3、ransition,EMT)是上皮細(xì)胞的一種病理轉(zhuǎn)化過程，即上皮細(xì)胞失去特性而獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的轉(zhuǎn)化過程，因此氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的機制是本研究的的關(guān)注點。參與組織器官的纖維化和創(chuàng)傷愈合另一個主要因素是轉(zhuǎn)化生長因子-β1（ Transforming growth factor-β1,TGF-β1），TGF-β1與受體結(jié)合，催化蛋白分子磷酸化，調(diào)節(jié)膠原蛋白、金屬蛋白酶組織抑制劑的轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，加強沉

4、積，還促進(jìn)纖維細(xì)胞的活化，并通過自分泌的方式持續(xù)促進(jìn)組織纖維化。研究證實氣管移植體狹窄處氣管粘膜中TGF-β1的表達(dá)顯著增高，因此TGF-β1增強EMT導(dǎo)致纖維組織過度增生，在氣管移植體狹窄病理生理過程中扮演重要角色。
　　微小RNA（MicroRNAs,MiRNAs）參與了多種細(xì)胞組織纖維增生、增殖、遷徙等生理病理過程，例如心肌纖維化、肺纖維化、腎小球纖維化、腫瘤細(xì)胞增殖遷移等，同時也在EMT的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Mi

5、RNAs家族的分子較多，MiR-200c是明星分子之一，研究表明，在其他組織器官纖維化病理過程中MiR-200c可通過TGF-β通路調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，來實現(xiàn)對EMT的調(diào)控作用。目前對氣管上皮細(xì)胞EMT過程中MiR-200c的調(diào)節(jié)作用研究較少。因此利用TGF-β1誘導(dǎo)的氣管上皮細(xì)胞建立上EMT的體外細(xì)胞模型，探索MiR-200c對EMT的影響是本實驗的重點。
　　目的：
　　建立氣管上皮細(xì)胞EMT的體外細(xì)胞模型，一

6、定程度上模擬氣管移植后移植體纖維結(jié)締組織過度增生導(dǎo)致管腔狹窄的病理改變過程；在細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，觀察MiR-200c的表達(dá)高低與TGF-β1誘導(dǎo)的氣管上皮細(xì)胞EMT模型的相關(guān)性，探究MiR-200c對治療氣管移植后移植體瘢痕狹窄的作用，為尋找預(yù)防和治療同種異體氣管移植后移植體狹窄的方法奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、相同濃度TGF-β1誘導(dǎo)氣管上皮細(xì)胞不同時段，定量PCR法檢測上皮細(xì)胞EMT相關(guān)分子基因水平表達(dá)情況；We

7、stern-blot法和免疫熒光方法檢測上皮細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)情況；建立氣管上皮細(xì)胞EMT模型，一定程度上模擬了氣管移植后移植體發(fā)生纖維組織過度增生的情況。
　　2、氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染高表達(dá)或低表達(dá)MiR-200c，再由相同濃度TGF-β1誘導(dǎo)，用CCK-8法檢測上皮細(xì)胞增殖能力；電子顯微鏡下觀察上皮細(xì)胞形態(tài)；定量PCR法檢測上皮細(xì)胞相關(guān)EMT分子基因水平表達(dá)情況；Western-blot和免疫熒光法檢測EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白表

8、達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、相同濃度TGF-β1（10ng/ml）誘導(dǎo)氣管上皮細(xì)胞0h、24h、36h、48h，定量PCR結(jié)果提示：上皮細(xì)胞EMT相關(guān)分子基因表達(dá)中，上皮標(biāo)志物E-cadherin基因表達(dá)隨時間的增加而下降，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和α-SMA基因表達(dá)隨時間的增加而升高；Western-blot法和免疫熒光法結(jié)果提示；上皮細(xì)胞EMT相關(guān)分子蛋白表達(dá)，上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)隨時間的增加而下

9、降，間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin和α-SMA的表達(dá)隨時間的增加而升高，表明成功建立了氣管上皮細(xì)胞EMT的體外細(xì)胞模型，充分模擬了氣管移植后移植體大量纖維組織增生導(dǎo)致管腔狹窄的病理過程；
　　2、下調(diào)氣管上皮細(xì)胞MiR-200c表達(dá)且TGF-β1刺激誘導(dǎo)，CCK-8檢測上皮細(xì)胞增殖能力提示：較單獨TGF-β1誘導(dǎo)組，下調(diào)+ TGF-β1誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖能力趨向于增殖能力強的間質(zhì)細(xì)胞；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)提示：較單獨TGF-β1誘導(dǎo)

10、組，下調(diào)+TGF-β1誘導(dǎo)組上皮細(xì)胞形態(tài)趨向于緊密連接消失的間質(zhì)細(xì)胞；上調(diào)氣管上皮細(xì)胞MiR-200c表達(dá)且TGF-β1刺激誘導(dǎo)，CCK-8檢測上皮細(xì)胞增殖能力提示：較單獨TGF-β1誘導(dǎo)組，上調(diào)+ TGF-β1誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖能力趨向正常上皮細(xì)胞；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)提示：較單獨TGF-β1誘導(dǎo)組，上調(diào)+ TGF-β1誘導(dǎo)組上皮細(xì)胞形態(tài)逆轉(zhuǎn)，趨向于正常鵝卵石樣形態(tài)；
　　3、下調(diào)氣管上皮細(xì)胞MiR-200c表達(dá)且TGF-β1刺

11、激誘導(dǎo)，定量PCR檢測上皮細(xì)胞EMT相關(guān)分子基因表達(dá)：較單獨TGF-β1誘導(dǎo)組或單獨下調(diào)MiR-200c組，下調(diào)+TGF-β1誘導(dǎo)組上皮標(biāo)志物E-cadherin基因表達(dá)量顯著下降，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和α-SMA基因表達(dá)量顯著升高；
　　4、下調(diào)氣管上皮細(xì)胞MiR-200c表達(dá)且TGF-β1刺激誘導(dǎo)，Western-blot和熒光免疫法檢測上皮細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)：較單獨TGF-β1誘導(dǎo)組或單獨下調(diào)MiR-200c組，下

12、調(diào)+TGF-β1誘導(dǎo)組上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)量下降顯著，間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin和α-SMA表達(dá)量顯著升高；上調(diào)氣管上皮細(xì)胞MiR-200c表達(dá)且TGF-β1刺激誘導(dǎo)，Western-blot和熒光免疫法檢測上皮細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)：較單獨TGF-β1誘導(dǎo)組，上調(diào)+TGF-β1誘導(dǎo)組上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin蛋白表達(dá)量逆轉(zhuǎn)增加，間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin和α-SMA表達(dá)量逆轉(zhuǎn)下降，均有統(tǒng)計學(xué)差異；