食管鱗癌中TGF-β1與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、食管癌是一種高侵襲性的腫瘤，世界范圍內(nèi)，食管癌患者死亡率占腫瘤患者死亡率的第六位，我國(guó)是食管癌的高發(fā)國(guó)家，河南省是高發(fā)省份。隨著治療手段的發(fā)展，食管癌的預(yù)后有所改善，但是其五年生存率仍然不容樂(lè)觀。浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是引起食管癌患者死亡的主要原因，因此，對(duì)食管癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制的探討已成為研究熱點(diǎn)之一。 近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育過(guò)程中的胚層和組織重建中存在一種現(xiàn)象：上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-meserlchymal tra

2、nsition，EMT)。最近研究認(rèn)為它不僅存在于多細(xì)胞生物的胚胎發(fā)生過(guò)程中，同時(shí)也存在于多種慢性疾病以及腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中。 EMT是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，包括：(1)細(xì)胞間連接(黏附連接、緊密連接、橋粒連接)解體，細(xì)胞分散；．(2)細(xì)胞骨架重排，形成細(xì)胞．基質(zhì)黏附，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。 (3)細(xì)胞基因型的改變：在EMT過(guò)程中表達(dá)上調(diào)的因子主要包括間葉細(xì)胞標(biāo)志物如纖維連接蛋白(fibronectin)、波形蛋白(Vimentin)

3、、神經(jīng)鈣黏素(N-cadhei-in)等，以及誘導(dǎo)EMT的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如snail、slug,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblastgrowth factor，F(xiàn)GF)；．還有對(duì)誘導(dǎo)EMT有輔助作用的基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)等。在EMT過(guò)程中表達(dá)下調(diào)的因子主要包括上皮細(xì)胞的標(biāo)志物如上皮鈣黏素(

4、E-cadherin)，β-連環(huán)素(β-catenin)，γ-連環(huán)素(γ-catenin)，細(xì)胞角蛋白18(cytokeratinl 8)等。已有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β在誘發(fā)EMT中起關(guān)鍵作用。有關(guān)食管鱗癌中是否存在EMT以及食管鱗癌中TGF-β1引發(fā)的EMT是否與食管癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討了食管癌組織及食管鱗癌細(xì)胞系EC9706中TGF-β1的表達(dá)及其與E-cadherin及Vimentin的關(guān)系；采用針對(duì)17GF-

5、β1的反義寡核苷酸干擾技術(shù)，抑制食管鱗癌細(xì)胞EC9706中TGF-β1的轉(zhuǎn)錄活性，探討抑制TGF-β1對(duì)E-cadtlerin及Vimentin表達(dá)的影響，觀察轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響及對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響，從而探討食管鱗癌細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的EMT；并探討TGF-β1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞EC9706增殖及凋亡的影響。探討食管鱗癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為食管癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的阻斷治療提供理論基礎(chǔ)。 材料和方法 1.采用

6、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了100例手術(shù)切除的食管鱗癌組織及其癌旁“正?！闭衬ぶ蠺GF-β1、E-cadlr]erin和Vimentin蛋白的表達(dá)情況。 2.采用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系EC9706中的TGF-β1、E-cadtlerin和Vimetltin蛋白及mRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。 3.針對(duì)TGF-β1第一啟動(dòng)子的核苷酸片段設(shè)計(jì)合成反義寡核苷酸(ASODN)，采用陽(yáng)離子聚合物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人

7、食管鱗癌EC9706細(xì)胞。 ①觀察TGFβ1-ASODN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。 ②采用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)方法、流式細(xì)胞術(shù)方法觀察TGFβ1-ASODN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)的變化。 ③采用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)方法觀察TGFβ1-ASODN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中E-cadherine與Vimelltin mRNA及蛋白表達(dá)的變化。 ④采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)TGFβ1-A

8、SODN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的變化。 4．采用流式細(xì)胞術(shù)、MTT觀察轉(zhuǎn)染TGF β 1-ASODN后，對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用陽(yáng)性率表示，陽(yáng)性率之間的比較采用x<'2>檢驗(yàn)(Chi-square)，陽(yáng)性率間相關(guān)性采用Kendall相關(guān)進(jìn)行比較；計(jì)量數(shù)據(jù)采用X±S表示，兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)(t-test)，兩組以上均數(shù)的比較用方差分析(

9、ANVOA)。顯著性水平α=0.05。 結(jié)果 1．TGF-β 1蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)(85．0﹪)明顯高于其在癌旁“正常”粘膜中的表達(dá)(27．0﹪)(P<0.01)，其在深層浸潤(rùn)組中的表達(dá)(90．6﹪)高于其在淺層浸潤(rùn)組中的表達(dá)(75．0﹪)(P<0.05)。 2．E-cadherin蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)(43﹪)明顯低于其在癌旁“正?！闭衬ぶ械谋磉_(dá)(85﹪)(P＜0.01)；Vimentin蛋白在食管鱗癌

10、中的表達(dá)(23﹪)高于其在癌旁“正?！闭衬ぶ械谋磉_(dá)(0﹪)(P＜0.05)。 3．在食管鱗癌組織中，TGF-β 1的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(T<,b>=-0．257，P＜0.05)；TGF-β 1的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(T<,b>=0．163，P<0.05)；Vimentin的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(T<'b>=-0．379，P＜0.01)。 4．RT-P

11、CR結(jié)果顯示EC9706細(xì)胞系中可檢測(cè)到TGF-β 1mRNA(0．43±0.09)、E-cadherin mRNA(0．22±0.06)、Vimentin mRNA(0．89±0.09)的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示在EC9706中存在TGF-β 1蛋白(43．57﹪)、E-cadherin蛋白(12．53﹪)和Vimentin蛋白(17．97﹪)的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示在EC9706中存在TGF-β 1蛋白(41．4﹪)、E-ca

12、dherin蛋白(12．2﹪)和Vimentin(17．8﹪)蛋白的表達(dá)。 5．轉(zhuǎn)染TGFβ 1-ASODN后，RT-PCR結(jié)果表明，TGF-β 1mRNA的表達(dá)水平(0．25±0．681)明顯低于轉(zhuǎn)染前(0．43±0.09)(P＜0.01)；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后TGF-β 1蛋白的表達(dá)(35．07﹪)明顯低于轉(zhuǎn)染前(43．57﹪)(P<0.01)，且細(xì)胞漿著色減弱；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后TGF-β 1蛋白的表達(dá)(

13、35．4﹪)明顯低于轉(zhuǎn)染前(41．38﹪)(P<0.01)。 6.RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染TGFβl-ASODN后，E-cadherin mRNA的表達(dá)(0.38±0.09)明顯高于轉(zhuǎn)染前(0.22±0.06)(P<0.01)；Vimentin mRNA的表達(dá)(0.73±0.07)低于轉(zhuǎn)染前(0.89±0.09)(P<0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后，E-cadherin蛋白的表達(dá)(17.13﹪)明顯高于轉(zhuǎn)染前(12

14、.53﹪)(P<0.01)；Vimentin蛋白的表達(dá)(14.15﹪)明顯低于轉(zhuǎn)染前(17.97﹪)(P03.01)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后E-cadherin蛋白的表達(dá)率(17.8﹪)明顯高于轉(zhuǎn)染前(12.2﹪)(P(0.01)；Vimentin蛋白的表達(dá)(14.9﹪)明顯低于轉(zhuǎn)染前(17.8﹪)(P<0.01)。 7.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)變圓，顆粒增多，呈立方形或橢圓形；而對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞輪廓清楚，呈紡錘形或長(zhǎng)梭

15、形。 8.劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TGFβl-ASODN的EC9706細(xì)胞的遷移距離在24h(0.14±0.02)、48h(0.30±0.06)、72h(0.45±0.05)均較轉(zhuǎn)染前24h(0.23±0.02)、48h(0.69±0.12)、72h(0.81±0.11)減少(P<0.05)。 9.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡百分率(0.69﹪)低于轉(zhuǎn)染前(0.96﹪)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染后，G1期的細(xì)胞百分比(6

16、2.9﹪)明顯低于轉(zhuǎn)染前(66.5﹪)(P

17、中TGF-βl蛋白表達(dá)與E-cadherin蛋白表達(dá)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Vimentin蛋白表達(dá)的正相關(guān)關(guān)系提示食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能存在TGF-βl引發(fā)的EMT。 2.轉(zhuǎn)染TGFβl-ASODN，可特異性地抑制食管鱗癌細(xì)胞EC9706中的TGF-βl表達(dá)。 3.TGFβ-ASODN轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，可導(dǎo)致細(xì)胞上皮性標(biāo)志物E-Cadherin表達(dá)上調(diào)、間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin表達(dá)下調(diào)、形態(tài)發(fā)生改變、移動(dòng)能力減弱，