miR-214下調(diào)CrkL抑制食管鱗癌上皮--間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究.pdf

1、目的:中國食管癌的發(fā)生率約為13/10萬，其中80％以上是鱗癌患者。雖然針對食管癌發(fā)病機理和診斷治療開展了大量的科學(xué)研究，在早期診斷和治療模式方面也取得了重要的突破和進展，但是食管癌患者的5年生存率仍低于20％。其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)被認(rèn)為是引起腫瘤發(fā)生侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素，腫瘤細(xì)胞通過啟動EMT，從原發(fā)腫瘤中分離出來，經(jīng)血流遷移至其他部位，然后發(fā)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)進行定植和生長，達到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的目的。
　　micro

2、RNA是一段長約20個堿基的單鏈非編碼RNA，可以與其靶基因3'非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，或者直接降解靶基因的mRNA。在食管鱗癌中，我們首次發(fā)現(xiàn)miR-214在癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織，同時發(fā)現(xiàn)miR-214的表達與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示miR-214可能參與調(diào)控食管鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　CrkL(CT10激酶調(diào)節(jié)子樣蛋白)是Crk信號接頭蛋白家族中的一員，參與多個信號通路的傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)

3、外蛋白之間的各種反應(yīng)。諸多研究證實CrkL在細(xì)胞的增殖、粘附、轉(zhuǎn)移、對病原體的應(yīng)答以及凋亡過程中均發(fā)揮作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在卵巢癌、胃癌、慢性粒細(xì)胞白血病和非小細(xì)胞肺癌中CrkL的表達均有上升。
　　在我們的前期工作中，通過基因表達譜芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析篩選可能與調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞EMT相關(guān)的miR-214靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CT10激酶調(diào)節(jié)子樣蛋白的3，-非翻譯區(qū)(3，-UTR)含miR-214潛在識別位點?；诖耍狙芯繑M探索miR-

4、214-CrkL通路對于食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT的影響
　　方法:本研究分為以下三個部分:
　　1、通過qPCR檢測miR-214及CrkL在食管鱗癌及對應(yīng)癌旁組織中mRNA水平上的表達。通過Western blot及免疫組化分別檢測CrkL在食管鱗癌及對應(yīng)癌旁組織中蛋白水平上的表達。統(tǒng)計分析miR-214及CrkL表達與食管鱗癌病人腫瘤的浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　2、通過miR-214模擬物/抑制物及相應(yīng)的陰

5、性對照轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109，確定轉(zhuǎn)染效率后檢測各組細(xì)胞中CrkL及EMT標(biāo)記物E鈣粘蛋白(E-cadherin)和N鈣粘蛋白(N-cadherin)在mRNA及蛋白層面表達水平的變化，并且通過Transwell和Wound-Healing實驗檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。
　　3、通過miR-214模擬物/pcDNA.CrkL共轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株，同時轉(zhuǎn)染miR-214模擬物/pcDNA.Null作為對照，考察

6、高表達CrkL能否消除miR-214對EMT的抑制作用，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灴疾靘iR-214對CrkL的靶向抑制作用。
　　結(jié)果:1、PCR結(jié)果表明食管鱗癌組織中的miR-214的表達相對于對照組明顯降低(P＜0.05)，而PCR及Western Blot的結(jié)果證實腫瘤組織中CrkL在rnRNA及蛋白層面的表達相對于對照組均明顯升高(P＜0.05)。miR-214的低表達和CrkL的高表達則提示腫瘤浸潤深度更深(P=0.0

7、4，P=0.013)并且更加容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.033，P=0.012)。2、在細(xì)胞層面上，通過miR-214模擬物/抑制物及相應(yīng)陰性對照分別轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-214模擬物組中CrkL和N-cadherin在翻譯前后水平的表達均低于對照組(P＜0.05)，而E-cadherin的表達卻明顯高于對照組(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染miR-214抑制物組中CrkL和N-cadherin的表達均高于對照組(P＜0.05)，而

8、E-cadherin的表達顯著低于對照組(P＜0.05)。同時Transwell和Wound-Healing實驗證實轉(zhuǎn)染miR-214模擬物的細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯低于對照組(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-214抑制物的細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯低于對照組(P＜0.05)。3、Eca-109細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-214模擬物/pcDNA.CrkL后，同時轉(zhuǎn)染miR-214/pcDNA.Null為對照，經(jīng)PCR和Western Blot實驗檢

9、測，實驗組中E-cadherin的表達明顯低于對照組(P＜0.05)，N-cadherin打的表達高于對照組(P＜0.05)。Transwell和Wound-Healing結(jié)果示相比于對照組，實驗組穿透基膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，遷移的速度明顯下降。熒光素酶基因報告試驗證實在CrkL的3'非翻譯區(qū)存在miR-214的結(jié)合位點，表明miR-214對CrkL表達的靶向抑制作用。
　　結(jié)論:miR-214在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達，而其潛在