miR-214對心肌細胞凋亡的影響及其分子機制研究.pdf

1、背景：隨著現(xiàn)代生活方式的改變、生活節(jié)奏的加快和人口老齡化的日益嚴(yán)重，心臟疾病發(fā)病率的升高和發(fā)病的普遍性、年輕化將日益突出。心肌細胞凋亡并不是某一個獨立的心臟疾病，而是作為一個病理過程參與了多種心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展，缺血性心肌病、心律失常、先天性心臟病、心臟過負荷、心肌的病毒感染、心肌重塑及心力衰竭等疾病均與其有著密切的關(guān)系。然而，目前對心肌細胞凋亡尚缺乏足夠深入的理解，引起凋亡的多種因素、各因素間的相互作用以及下游信號通路的傳遞均有待進

2、一步深入研究。miRNA是非編碼RNA的一類，是由內(nèi)源基因編碼的單鏈RNA分子，長度約為18-24個核苷酸。目前的研究已經(jīng)表明這類小分子物質(zhì)在基因調(diào)控中起著廣泛的作用。對于心肌細胞凋亡而言，闡明miRNA是如何通過某些途徑調(diào)控這一復(fù)雜過程是非常必要的，值得進一步探索。本研究希望能研究某個miRNA在心肌細胞凋亡的調(diào)控中扮演的作用。
　　目的：采用real time PCR的方法驗證miR-214在心肌細胞接受氧化應(yīng)激后的表達情況。

3、根據(jù)流式細胞技術(shù)及western Blot等實驗方法表明miR-214在心肌細胞中的生物學(xué)功能。并且通過生物信息學(xué)的方法，對miR-214的下游靶點進行預(yù)測并實驗驗證。結(jié)合miR-214轉(zhuǎn)基因小鼠模型，進一步研究miR-214調(diào)控心肌細胞凋亡的分子機制。
　　方法：⑴分別以不同濃度和不同作用時間的過氧化氫刺激大鼠原代心肌細胞，模擬體內(nèi)心肌細胞接受氧自由基氧化應(yīng)激的過程，采用real time PCR檢測miR-214的表達變化情況

4、;⑵在心肌細胞內(nèi)過表達miR-214后再予適當(dāng)濃度過氧化氫處理，與對照組相比，通過流式細胞術(shù)和western blot的方法分別檢測凋亡細胞數(shù)的比例以及相關(guān)蛋白表達情況;⑶使用在線預(yù)測軟件對miR-214進行靶基因預(yù)測，然后利用real time PCR、western Blot等方法驗證靶基因mRNA以及蛋白表達量是否在miR-214過表達后發(fā)生相應(yīng)變化，并利用熒光素酶雙報告系統(tǒng)對miR-214的靶序列進行驗證;⑷結(jié)合miR-214轉(zhuǎn)

5、基因小鼠模型，利用real time PCR、western blot及免疫組化等方法再次從動物水平驗證miR-214下游靶基因并分析其調(diào)控凋亡過程的具體分子機制。
　　結(jié)果：①不同濃度的過氧化氫同時作用心肌細胞6小時，隨著濃度的提高，miR-214的表達量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。經(jīng)統(tǒng)計檢驗，心肌細胞經(jīng)過氧化氫應(yīng)激時miR-214表達量明顯低于正常心肌細胞。100uM終濃度的過氧化氫分別作用心肌細胞予不同的時間，選取0h、1h、2h、

6、4h、8h及12h為檢測點，隨著氧化應(yīng)激作用時間的延長，miR-214的表達量呈逐漸降低的趨勢。②體外轉(zhuǎn)染miR-214 mimic至心肌細胞使miR-214過表達，然后再分別予0uM(NC)和100uM濃度的過氧化氫處理誘導(dǎo)其凋亡。通過流式細胞技術(shù)和westernblot實驗表明，miR-214過表后的心肌細胞具有較低的細胞凋亡率，凋亡相關(guān)蛋白active-caspase3及cleaved PARP的表達也較對照組低。③應(yīng)用在線靶基因

7、預(yù)測軟件，預(yù)測在大鼠原代心肌細胞內(nèi)，bim、bak1、bax、bnip3和casp7都有可能是miR-214的靶基因，進一步通過real time PCR和westernBlot實驗檢測過表達miR-214后mRNA水平和蛋白水平均有下調(diào)的有bim、bax及casp7。接下來的熒光素酶雙報告系統(tǒng)分析進一步表明它們有可能是miR-214的直接作用靶點，其3'-UTR中都存在與miR-214結(jié)合的作用位點。④通過構(gòu)建miR-214轉(zhuǎn)基因小鼠