Survivin對(duì)心肌細(xì)胞的抗凋亡作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、內(nèi)源性的硫化氫(H<,2>S)被譽(yù)為是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種重要的氣體信號(hào)分子，它具有重要的生理意義，在心血管系統(tǒng)，它有舒張血管降低血壓、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖減輕血管重構(gòu)以及減小缺血再灌注時(shí)的心肌梗死面積等多種生物學(xué)效應(yīng)。但其對(duì)缺血缺氧引發(fā)的心肌細(xì)胞的凋亡是否有直接作用至今還未見(jiàn)報(bào)道。我們用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞研究H<,2>S對(duì)心肌細(xì)胞的直接作用及其分子信號(hào)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)生理濃度下的NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞能

2、夠抑制缺氧/復(fù)氧引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡，呈濃度依賴性，這是H2S抗心肌細(xì)胞凋亡的首次報(bào)道。NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞能夠增加Survivin和Bcl-2表達(dá)，抑制Caspase3前體斷裂。Survivin參與了NaHS對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，但是Survivin與Bcl-2和Caspase3的關(guān)系是怎樣是我們下一步要解決的問(wèn)題。我們首次發(fā)現(xiàn)GSK3 β的活性在NaHS抗心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，但是其作用機(jī)制如Survivin的表達(dá)是否受到GS

3、K3 β的活性的影響，GSK3β的上游調(diào)控分子是什么，GSK3β通路與MAPK通路間是否有串話等還有待進(jìn)一步的研究。 心肌細(xì)胞上的內(nèi)阿片類(lèi)受體的激活能夠發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的直接保護(hù)作用。阿片受體屬G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，分為μ、δ、κ三種亞型，大量的研究證實(shí)在心肌細(xì)胞上δ、κ兩種亞型的受體占據(jù)了主導(dǎo)地位，究竟是哪種內(nèi)阿片類(lèi)受體參與了對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用仍然是一個(gè)受爭(zhēng)議的問(wèn)題。Survivin蛋白是存在于胚胎發(fā)育和腫瘤組織中的凋亡

4、調(diào)節(jié)蛋白，在終末分化的細(xì)胞中不存在，但最近有研究證實(shí)其在心肌細(xì)胞中也有表達(dá)，那么其是否有直接抗凋亡作用以及其是否參與內(nèi)阿片類(lèi)受體的激活抗心肌細(xì)胞凋亡的作用及參與其中的信號(hào)通路是什么也是我們關(guān)注的重點(diǎn)。另外，Bcl-2，Bax 是介導(dǎo)線粒體凋亡途徑中的重要蛋白，它們是否參與了阿片受體激活對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用還未可知。 本實(shí)驗(yàn)以新生大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，用無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)的方法建立細(xì)胞凋亡的體外模型。用DNA電泳和TUNEL檢測(cè)斷裂

5、的DNA片段，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime-PCR)和Western blot檢測(cè)凋亡蛋白和信號(hào)分子，用RNA干擾和基因過(guò)表達(dá)的方法研究survivin的作用。 結(jié)果表明，非選擇性的內(nèi)阿片類(lèi)受體激動(dòng)劑嗎啡預(yù)處理可以明顯降低無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡百分率，這種作用可以被非選擇性的內(nèi)阿片類(lèi)受體拮抗劑納洛酮(Naloxone)和選擇性δ受體拮抗劑Natrindole所阻斷，不能被選擇性κ受體拮抗劑GNTI所阻斷，證實(shí)

6、了δ受體參與了對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，因此我們選擇特異性δ受體激動(dòng)劑DADLE進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)DADLE能夠早期抑制心肌細(xì)胞凋亡時(shí)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，阻止線粒體跨膜電位△Ψmt的下降，并且DADLE還能夠促使ERK信號(hào)分子出現(xiàn)發(fā)生時(shí)間較晚但維持時(shí)間較長(zhǎng)的一種激活狀態(tài)，而且Bcl-2，基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)也伴隨著ERK的激活而升高，DADLE同時(shí)也抑制了Bax蛋白從胞漿到線粒體的轉(zhuǎn)位，除此之外，我們首次發(fā)現(xiàn)DADLE還能夠促使Survi

7、vin基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，發(fā)揮了對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。ERK的阻斷劑PD98059和U0126在阻斷了Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)和促進(jìn)Bax蛋白從胞漿到線粒體的轉(zhuǎn)位的同時(shí)也抑制了PD98059抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，由此我們首次證明ERK是心肌細(xì)胞中Survivin的上游調(diào)控激酶。用RNA干擾的方法下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Survivin明顯阻斷DADLE的保護(hù)作用，證明Survivin直接介導(dǎo)了DADLE對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用；過(guò)表達(dá)Surv

8、ivin蛋白的細(xì)胞能夠抵抗無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，證明Survivin基因的激活能夠直接發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。 綜上所述，我們的研究首次發(fā)現(xiàn)Survivin對(duì)心肌細(xì)胞有直接的保護(hù)作用并且首次證實(shí)Survivin介導(dǎo)了DADLE對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，ERK 信號(hào)通路和 P13-K信號(hào)通路是Survivin的上游激活分子信號(hào)通路，并且DADLE還通過(guò)減少活性氧(ROS)的產(chǎn)生，阻止線粒體跨膜電位△Ψmt的下降，促進(jìn)Bc