干預(yù)肥大心肌細(xì)胞代謝途徑的抗凋亡效應(yīng)研究.pdf

1、大量的研究表明,心肌細(xì)胞凋亡是心肌肥厚向心力衰竭轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制,在急性缺血再灌注的病理損傷機(jī)制中也起著重要的作用.目前,對細(xì)胞凋亡的生化過程和信號傳導(dǎo)途徑已基本闡明,即死亡受體和線粒體凋亡途徑,引發(fā)終極caspase級聯(lián)反應(yīng)致細(xì)胞凋亡,線粒體調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制已被廣泛認(rèn)同.心肌是能量代謝非常活躍的組織,線粒體的含量非常豐富.線粒體的主要功能是能量代謝,在心肌細(xì)胞生理功能中舉足輕重,但近年來發(fā)現(xiàn),線粒體與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切,具有凋亡調(diào)節(jié)功能.

2、線粒體代謝異?？杀憩F(xiàn)為代謝途徑改變或電子傳遞受損,它們與凋亡的關(guān)系尚不清楚.心肌肥大時(shí),能量代謝途徑發(fā)生了顯著改變,脂肪酸氧化顯著降低,而糖的利用明顯增加,相應(yīng)地調(diào)控脂肪酸氧化的酶基因表達(dá)下降,出現(xiàn)胚胎時(shí)代謝模式.這種能量底物優(yōu)勢轉(zhuǎn)換的機(jī)制是多方面的,如慢性缺血缺氧、細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)代謝途徑的相關(guān)因子的濃度和酶的磷酸化程度的改變等,起關(guān)鍵作用可能是PPARalpha/PGC-1復(fù)合體的失活,PPARalpha/PGC-1復(fù)合體是調(diào)節(jié)脂肪酸氧化

3、酶基因表達(dá)的主要因子.心肌肥大時(shí),PPARalpha/PGC-1失活可能參與了能量底物轉(zhuǎn)換的多個(gè)水平上的調(diào)控,包括這些脂肪酸氧化酶基因表達(dá)下降和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑產(chǎn)生的翻譯后效應(yīng).但導(dǎo)致PPARalpha/ PGC-1復(fù)合體的失活的機(jī)制目前欠清楚.近年來研究發(fā)現(xiàn),心肌細(xì)胞能量代謝功能失衡與心肌肥大、心力衰竭有關(guān),并且認(rèn)為是由于線粒體電子傳遞體系異常生成大量

4、的氧自由基引起細(xì)胞凋亡.線粒體能量代謝依靠脂肪酸和糖氧化,二者相互調(diào)節(jié),各種中間產(chǎn)物代謝完全.但在缺血缺氧等條件下,容易出現(xiàn)代謝中間環(huán)節(jié)受阻,有害產(chǎn)物堆積.線粒體代謝途徑的改變可能與心肌細(xì)胞損傷有關(guān).臨床上,應(yīng)用活化糖代謝或抑制脂肪酸代謝的藥物,已收到了良好的心絞痛治療效果.但是,目前還不清楚是脂肪酸代謝活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,還是糖代謝有氧氧化活化抑制細(xì)胞凋亡作用,也不清楚活化糖代謝有氧氧化或抑制脂肪酸代謝的藥物能否抑制細(xì)胞凋亡,闡明這些問

5、題,對于指導(dǎo)我們在防治或延緩心肌肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)化具有非常重要的意義.為了進(jìn)一步探索心肌肥大時(shí)線粒體代謝途徑由脂肪酸氧化向糖代謝轉(zhuǎn)變以及肥大心肌缺血缺氧時(shí)脂肪酸氧化又突然活化這些代謝現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制,闡明線粒體代謝途徑改變與細(xì)胞凋亡的關(guān)系.該課題進(jìn)行了體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大;肥大心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧的培養(yǎng);檢測肥大心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧時(shí)細(xì)胞凋亡及能量代謝的變化;激活或抑制糖代謝時(shí),PDH、CPT活性及糖氧化率和脂肪酸代謝率;激活或抑制脂肪酸代

6、謝時(shí),PDH、CPT活性及糖氧化率和脂肪酸代謝率.方法:用組織胰蛋白酶消化法分離、培養(yǎng)2-3d Wistar大鼠心肌細(xì)胞.無血清的培養(yǎng)基中加入0.1μmol/L AngⅡ+1μmol/L NE 培養(yǎng)12h,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大并通過測定細(xì)胞的表面積、蛋白質(zhì)的含量及[<'3>H]-Leu摻入量三種方法來鑒定.肥大心肌細(xì)胞在有血清的培養(yǎng)基中持續(xù)給95﹪N<,2>和5﹪CO<,2> ,控制氧分壓在5mmHg以下缺氧培養(yǎng)8h后,恢復(fù)給氧(20﹪O<

7、,2>,5﹪CO<,2>)培養(yǎng).在此基礎(chǔ)上,分別在復(fù)氧后0,4,8,12h進(jìn)行以下檢測:① 用TUNEL法檢測細(xì)胞的凋亡,取5個(gè)高倍視野(400倍),記數(shù)200個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算出凋亡細(xì)胞率;② PDH活性測定:丙酮酸底物摻入心肌細(xì)胞代謝產(chǎn)生乙酰CoA,乙酰CoA與<'14>C-草酰乙酸生成<'14>C枸櫞酸,用液體閃爍儀定量生成的乙酰CoA來反映PDH活性;③ CPT活性測定: <'3>H-肉堿底物、軟脂酸與提取的心肌細(xì)胞線粒

8、體溫育,含<'14>C產(chǎn)物用液體閃爍儀定量.④ 糖氧化測定:[U-<'14>C]-D-葡萄糖與細(xì)胞溫育1h,收集<'14>CO<,2>,液閃測定.⑤脂肪酸氧化測定:Na[1-<'14>C]軟脂酸與細(xì)胞溫育1h,收集14CO<,2>,液閃測定.干預(yù)實(shí)驗(yàn):肥大的心肌細(xì)胞缺氧培養(yǎng)8h后,換無血清培養(yǎng)基有氧培養(yǎng),同時(shí)加入干預(yù)試劑,分100 ,1000,10 000 μmol/L DCA、 0.1,1,10 μmol/L Antimycin A、

9、0.1 ,1,10 μmol/L TMZ和20,40,80 μmol/L L-carnitine幾組,各自分別在8h測定每組PDH和CPT活性、糖氧化率、脂肪酸代謝率; 復(fù)氧時(shí)加1000 μmol/L DCA、1 μmol/L Antimycin A、5 μmol/L TMZ和40μmol/L L-carnitine分別在0,4,8,12h測定各自PDH活性、CPT活性、糖氧化率、脂肪酸代謝率.結(jié)果:1. 心肌細(xì)胞肥大的誘導(dǎo)和鑒定:在加

10、入Ang Ⅱ+NE培養(yǎng)12h培養(yǎng)后,心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量增加70.4﹪,心肌細(xì)胞表面積明顯增加(49.7﹪);[<'3>H]-Leu摻入量顯著提高 (115.2﹪),心肌細(xì)胞發(fā)生了肥大.2. 缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞凋亡率和線粒體代謝:肥大心肌細(xì)胞缺氧8h后凋亡率為10.4﹪左右,而非肥大心肌細(xì)胞凋亡率為8.3﹪,但隨著有氧環(huán)境的恢復(fù),肥大心肌細(xì)胞凋亡加速,12h后凋亡率達(dá)到22.8﹪以上,明顯高于對照組(P<0.05).表明缺氧復(fù)氧對肥大

11、心肌細(xì)胞比正常心肌更容易引起凋亡.3. 缺氧復(fù)氧條件下線粒體代謝:缺氧時(shí),PDHa活性降低(P<0.05),PDHt變化不是很明顯(P>0.05),PDHa/PDHt明顯降低(P<0.05);心肌細(xì)胞糖氧化下降48﹪;CPT活性降低(P<0.05),脂肪酸氧化下降60﹪.復(fù)氧時(shí),PDHa、PDHa/PDHt、CPT逐漸恢復(fù)到缺氧前的水平, 8h后糖氧化、脂肪酸氧化基本回到缺氧前的水平(P>0.05).4. 干預(yù)實(shí)驗(yàn):加入100 μmol

12、/L—10 000 μmol/LDCA后, PDHa活性較對照組增強(qiáng)(P<0.05), PDHa/PDHt比值上升,且呈現(xiàn)量效關(guān)系;PDHt與對照組相比改變不明顯(P>0.05),糖氧化增強(qiáng), CPT活性和脂肪酸的氧化下降(P<0.05).相反地,Antimycin A在濃度0.1 μmol/L-10 μmol/L時(shí)抑制PDHa活性和糖氧化,在1 μmol/L-10 μmol/L增強(qiáng)CPT活性和脂肪酸氧化.1 μmol/L-10 μmo

13、l/L TMZ 增加PDHa活性和PDHa/PDHt比值(P<0.05或P<0.01),提高糖氧化,抑制脂肪酸氧化,對CPT活性無明顯影響(P>0.05).L-carnitine在濃度40-80 μmol/L增加PDHa活性和提高PDHa/PDHt比值,對糖氧化無明顯影響(P>0.05),增強(qiáng)CPT活性,提高脂肪酸氧化(P<0.05或P<0.01).1 000 μmol/L DCA、1 μmol/L Antimycin A、5 μmol

14、/L TMZ和40 μmol/L L-carnitine各自對肥大心肌細(xì)胞PDH活性、CPT活性、糖氧化、脂肪酸氧化作用無明顯的時(shí)-效關(guān)系.結(jié)論:1. 我們通過測定細(xì)胞表面積、細(xì)胞蛋白含量、細(xì)胞蛋白合成速率三種方法證實(shí)了Ang Ⅱ+NE能誘導(dǎo)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞肥大,這是體外培養(yǎng)肥大心肌細(xì)胞簡便和實(shí)用的模型.2. 在缺氧復(fù)氧的條件下,肥大心肌細(xì)胞比正常心肌細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡.3. 缺氧時(shí)肥大心肌細(xì)胞的糖氧化和脂肪酸氧化下降,復(fù)氧后,二者均能