缺氧-復氧誘導肥大的心肌細胞凋亡的機制研究.pdf

1、背景:缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion，I/R)損傷是心肌梗死、心肺旁路術和心臟移植的一個主要并發(fā)癥。既往認為缺血/再灌注損傷中的心肌細胞死亡主要是細胞壞死。然而近年來研究證實心肌細胞凋亡在心肌缺血/再灌注中的細胞死亡中起重要作用而且可能是反復缺血后肥大心肌向心力衰竭轉變的重要機制。目前缺血/再灌注損傷中的肥大心肌細胞凋亡的具體機制仍不清楚。線粒體功能障礙與心肌再灌注損傷的發(fā)病機制密切相關，因為線粒體的主要功能是能

2、量代謝，在心肌細胞中極為豐富，同時它又是促凋亡分子的主要來源。 線粒體通過釋放細胞色素c至胞漿而誘發(fā)caspase級聯(lián)反應，隨后使caspase-3活化，最后導致細胞凋亡的發(fā)生。這是caspase依賴性細胞死亡途徑。因此有人研究了caspase-3抑制劑能否通過減輕心肌細胞凋亡而降低心肌缺血/再灌注損傷的程度。結果發(fā)現(xiàn)caspase-3抑制劑并不能降低心肌梗死的面積。這提示細胞色素caspase-3在缺血/再灌注中的作用還有待進

3、一步明確，同時提示除此之外可能還有其它的凋亡途徑參與缺血/再灌注損傷中的心肌細胞凋亡過程。近年來發(fā)現(xiàn)凋亡誘導因子(AIF)是存在于線粒體膜間隙中一種促凋亡分子。受凋亡刺激時AIF從線粒體中釋放至并轉位至細胞核，進而誘導細胞凋亡。caspase抑制劑不能抑制AIF的促凋亡作用，也即AIF介導了caspase非依賴性的細胞凋亡途徑。然而AIF在心肌細胞凋亡中的作用仍不清楚。另一方面，作為線粒體功能障礙之一的代謝途徑改變與心肌細胞損傷有關。二

4、氯乙酸、抗霉素A、曲美他嗪和L-肉堿可直接或間接影響葡萄糖氧化和脂肪酸氧化，同時它們具有抗凋亡或促凋亡作用。因此能量代謝途徑改變也可能在心肌細胞凋亡中起重要作用。目前仍不清楚能量代謝途徑改變是否與細胞色素c、AIF有關。 目的:1.觀察缺氧/復氧誘導肥大心肌細胞凋亡的作用，探討兩者間的關系。 2.觀察細胞色素c表達、caspase-3活性變化及caspase-3抑制劑對凋亡的影響，探討caspase依賴性途徑在缺氧/復氧

5、后肥大心肌細胞凋亡中的作用。 3.觀察AIF表達變化及AIFsiRNA轉染對凋亡的影響，探討AIF介導的caspase非依賴性途徑在缺氧/復氧后肥大心肌細胞凋亡中的作用。 4.觀察干預能量代謝后細胞凋亡的變化、細胞色素c和AIF表達變化及caspase-3活性變化，探討代謝途徑改變在缺氧/復氧后肥大心肌細胞凋亡中的作用及機制。 方法:1.模型建立及缺氧及復氧與肥大心肌細胞凋亡的關系：采用胰酶消化法、差速貼壁法、阿

6、糖胞苷加入法分離、純化1-2d新生昆明系小鼠心肌細胞。分離的心肌細胞培養(yǎng)于DMEM/F12。α-Sacromericactin免疫細胞化學法及電鏡鑒定心肌細胞；AngⅡ刺激48h誘導心肌細胞肥大，Bradford法及[3H]-亮氨酸摻入法分別測定總蛋白含量和蛋白質合成速率。以缺氧(5％的二氧化碳，95％氮氣)+低糖DMEM、復氧模擬缺血/再灌注誘導肥大心肌細胞凋亡，用電鏡法鑒定凋亡細胞，TUNEL染色法和Hoechst33258染色法觀

7、察缺氧8h、12h及缺氧/復氧4h時的凋亡規(guī)律。 2.caspase依賴性途徑在缺氧及復氧后肥大心肌細胞凋亡中的作用：于缺氧8h、12h及缺氧/復氧4h時，westernblot法檢測細胞色素c蛋白表達及胞漿轉位。RT-PCR法檢測細胞色素cmRNA表達。比色法檢測caspase-3活性。JC-1染色法觀察了缺氧、復氧時線粒體膜電位變化。檢測了caspase-3抑制劑對缺氧12h及缺氧12h/復氧4h時細胞凋亡的影響(Hoech

8、st33258染色法)。 3.AIF在缺氧及復氧后肥大心肌細胞凋亡中的作用：于缺氧8h、12h及缺氧/復氧4h時，westernblot法檢測AIF蛋白表達及核轉位。RT-PCR法檢測AIFmRNA表達。觀察了AIF小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)轉染對缺氧12h及缺氧12h/復氧4h后肥大心肌細胞凋亡的影響。westernblot法及RT-PCR法檢測了AIFsiRNA轉染致AIF基因沉默的效

9、率。 4.干預代謝途徑對缺氧/復氧時肥大心肌細胞凋亡的影響及機制：用改變糖代謝、脂肪酸代謝的試劑二氯乙酸、抗霉素A、曲美他嗪和L-肉堿干預后，觀察了缺氧12h及缺氧12h/復氧4h時肥大心肌細胞凋亡的變化(Hoechst33258染色法)，westernblot法檢測細胞色素c胞漿轉位及AIF核轉位變化，RT-PCR法檢測兩者的mRNA變化。 結論:1.采用胰酶消化法、差速貼壁法及Ara-C加入法及AngⅡ刺激法成功地進

10、行了新生小鼠肥大心肌細胞體外培養(yǎng)。缺氧可誘導肥大心肌細胞凋亡，復氧可進一步加強細胞凋亡，缺氧/復氧是研究肥大心肌細胞凋亡的理想模型. 2.缺氧及缺氧/復氧時肥大心肌細胞細胞色素cmRNA、蛋白表達及胞漿轉位增加、caspase-3活性增加，而抑制caspase-3活性可顯著降低缺氧及缺氧/復氧時肥大心肌細胞凋亡。提示：caspase依賴性細胞死亡途徑是缺氧及缺氧/復氧時肥大心肌細胞凋亡的重要機制之一。 3.缺氧/復氧時肥

11、大心肌細胞AIFmRNA、蛋白表達及核轉位增加，而且其核轉位不受caspase抑制劑的影響。AIFsiRNA轉染可抑制心肌細胞AIF蛋白及mRNA表達，著減輕缺氧/復氧時肥大心肌細胞凋亡。提示：AIF介導的caspase非依賴性的細胞死亡途徑也參與缺氧/復氧時肥大心肌細胞凋亡過程。 4.二氯乙酸、曲美他嗪、L-肉堿具有抗細胞凋亡作用，并伴隨著細胞色素c、AIFmRNA表達及蛋白的轉位降低，caspase-3活性降低，而抗霉素A有