PUMA介導缺氧復氧大鼠心肌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、凋亡引起的心肌細胞損失是缺血/再灌注損傷(ischemia/perfusion injury,IRI)的重要病理特征。闡明對心肌IRI中心肌細胞凋亡起關鍵性作用的蛋白質及其信號轉導機制,對揭示心肌IRI的本質尋找并確立藥物靶點,有效防治心肌IRI具有重要的現實意義。
　　 p53上調凋亡調制物(p53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA)是近年發(fā)現促凋亡作用最強的BH3-only蛋白質

2、家族成員之一,是Bax/Bak上游的主要促凋亡蛋白質,能隔離所有的Bcl-2抗凋亡蛋白質作用。PUMA在多種病理性因素的刺激下通過p53依賴和非依賴途徑激活介導細胞凋亡,在凋亡通路上發(fā)揮著舉足輕重的作用。
　　 本實驗采用原代大鼠心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型模擬在體心肌IRI,探討促凋亡蛋白PUMA是否介導H/R誘導心肌細胞凋亡的發(fā)生?遏制PUMA表達是否可以下調心肌細胞凋亡而達到

3、減輕H/R損傷的作用?
　　 第一部分、PUMA在大鼠心肌細胞H/R損傷中的作用及意義
　　 目的:
　　 應用乳鼠原代心肌細胞H/R損傷模型,探討PUMA在大鼠心肌細胞H/R損傷中的作用及意義。
　　 方法：
　　 原代培養(yǎng)的心肌細胞被隨機分為5組,實驗重復3次。①正常對照(control)組；②H/R2h組；③H/R4h組；④H/R6h組；⑤H/R12h組。采用生化自動分析儀測定LDH活性、M

4、TT法測定細胞存活率、Annexin V-FITC和PI聯合染色的流式細胞術檢測凋亡率、RT-PCR和Western blot方法檢測PUMA及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的mRNA及蛋白的表達變化及分光光度法檢測Caspase3活性變化。
　　 結果：
　　 1、H/R誘導心肌細胞凋亡
　　 H/R處理后心肌細胞凋亡率迅速上升,其中以H/R6h最為明顯,細胞凋亡率(23.44±4.16)％顯著高于Contro

5、l組(3.12±0.46)％(P<0.05)；H/R12h Caspase3活性達峰值為Control組的(4.57±0.48)倍(P<0.05)。
　　 2、H/R誘導PUMA及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達變化RT-PCR圖像分析顯示:PUMA mRNA H/R2h開始升高(0.45±0.05),6h達峰值(0.76±0.06),持續(xù)到12h(0.71±0.07)仍高于Control組(0.29±0.02)(P<0.05

6、)；Bax mRNA在H/R2h開始升高(0.63±0.07),6h達峰值(0.96±0.09),持續(xù)到12h(0.790.09)仍高于Control組(0.28±0.05)(P<0.05)；與Control組(0.974±0.08)相比,Bcl-2 mRNA H/R2h開始下降(0.82±0.07),12h降至最低(0.47±0.05)(P<0.05)。
　　 Western Blot圖像分析顯示:Control組中PUMA蛋

7、白的表達量很低(0.08±0.01),H/R4h出現明顯上調(0.33±0.04),6h顯著升高(0.68±0.07),12h達峰值(0.72±0.07)(P<0.05)；與Control組(0.28±0.04)相比,Bax蛋白H/R2h開始升高(0.49±0.05),6h顯著升高(0.92±0.08),12h達峰值(0.97±0.10)(P<0.05)；與Control組(0.68±0.07)相比,Bcl-2蛋白H/R2h開始降低(0

8、.56±0.06),12h降至最低(0.26±0.02)(P<0.05)。
　　 結論：
　　 H/R誘導心肌細胞凋亡。PUMA在正常培養(yǎng)的心肌細胞中表達很低,心肌細胞H/R后迅速上調,其表達變化與心肌細胞凋亡率、Caspase3活性變化及凋亡相關蛋白Bax表達變化正相關,與Bcl-2表達變化負相關,提示促凋亡蛋白PUMA可能通過上調Bax表達及下調Bcl-2表達,導致Caspase3活性增加介導H/R誘導的心肌細胞凋亡

9、。
　　 目的:
　　 應用脂質體轉染的方法將PUMA特異性siRNA(si－PUMA)轉染心肌細胞,探討si－PUMA對心肌細胞H/R損傷的影響。
　　 方法：
　　 原代培養(yǎng)的心肌細胞被隨機分為4組,實驗重復3次。①正常對照(control)組；②H/R6h組；③轉染錯義siRNA+H/R6h組(si-SCR)；④轉染si-PUMA+H/R6h組(si-PUMA)。siRNA干擾心肌細胞PUMA表達3

10、6 h后,制備心肌細胞H/R損傷模型,在H/R6h即PUMA表達最顯著時間點,觀察下調PUMA表達對心肌細胞H/R損傷的作用。觀察指標和方法同前。
　　 結果：
　　 1、si-PUMA特異性下調心肌細胞PUMA表達。si-PUMA組PUMA mRNA(0.10±0.002)顯著低于H/R6h組(1.06+0.08)(P<0.05)；si-PUMA組PUMA蛋白(0.33±0.04)顯著低于H/R6h組(0.84±0.0

11、9)(P<0.05)。
　　 2、與H/R6h組(60.7±6.84)％相比,si－PUMA組細胞存活率(75.3±4.29)％明顯上調(P<0.05)；與H/R6h組(1237±107)U/L相比,si－PUMA組LDH活性(802±55)U/L顯著降低(P<0.05)；與H/R6h組(23.96±5.02)％相比,si－PUMA組細胞凋亡率(14.16±4.02)％明顯下降(P<0.05)。
　　 3、與H/R6h組

12、(1.06±0.07)相比,si－PUMA組Bax蛋白(0.64±0.05)表達下調(P<0.05)；與H/R6h組(0.52±0.06)相比,si-PUMA組Bcl-2蛋白(0.68±0.08)表達上調(P<0.05)；與H/R6h組(4.62±0.34)相比,si-PUMA組Caspase3活性(2.97±0.25)活性下降(P<0.05)。
　　 結論：
　　 化學合成的si-PUMA可以通過脂質體方法高效轉染心肌

13、細胞。特異性干擾PUMA表達后,心肌細胞存活率升高、LDH溢出減少,凋亡率明顯下調,其主要機制可能是si-PUMA干擾PUMA的促凋亡作用,導致Bax表達下調和Bcl-2表達上調而使Caspase-3的活化程度降低,造成心肌細胞凋亡率下降。提示si-PUMA對心肌細胞H/R損傷具有較好的保護作用。
　　 本文結論:
　　 1、促凋亡蛋白PUMA介導了H/R心肌細胞損傷,是H/R誘導心肌細胞凋亡的關鍵分子。