Exenatide對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞線粒體功能的保護(hù)作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:Exenatide對缺氧復(fù)氧條件下H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用
　　目的:探討胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)類似物艾塞那肽(Exenatide)對缺氧復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)條件下H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　方法:建立H9c2心肌細(xì)胞H/R模型。激光共聚焦及Western blot檢測正常H9c2細(xì)胞GLP-1受體(GLP-1

2、receptor, GLP-1 R)表達(dá);給予相應(yīng)濃度Exenatide預(yù)處理后，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率;分光光度計檢測培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平及細(xì)胞Capase-3活性，ELISA檢測培養(yǎng)液上清肌酸激酶同工酶(creatinekinase-MB，CK-MB)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;Western blot檢測細(xì)胞Cieaved-caspase-3及細(xì)胞質(zhì)Cytochrom

3、e-c水平。
　　結(jié)果:①正常H9c2心肌細(xì)胞有GLP-1R表達(dá)。②與Control組相比，H/R組H9c2細(xì)胞存活率顯著降低(P＜0.05);細(xì)胞培養(yǎng)液LDH和CK-ME水平顯著升高（P＜0.05）;細(xì)胞凋亡率(26.35±0.88 vs7.32±0.43)顯著增加(P＜0.05);細(xì)胞Cleaved-caspase-3(0.86±0.02 vs0.24±0.03)及細(xì)胞質(zhì)Cytochrome-c(0.73±0.06 vs0.2

4、8±0.01)水平顯著升高（P＜0.05）;細(xì)胞Capase-3活性(4.69±0.42 vs1.00±0.00)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。③與H/R組相比，Exenatide+H/R組H9c2細(xì)胞存活率顯著增加(P＜0.05);細(xì)胞培養(yǎng)液LDH和CK-MB水平顯著降低(P＜0.05);細(xì)胞凋亡率(16.43±0.68 vs26.35±0.88)顯著減少(P＜0.05);細(xì)胞Cleaved-caspase-3(0.41±0.02 vs0

5、.86±0.02，P＜0.05)及細(xì)胞質(zhì)Cytochrome-c(0.35±0.01 vs0.73±0.06)水平顯著減少(P＜0.05);細(xì)胞Capase-3活性(2.86±0.61 vs4.69±0.42)顯著降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論:Exenatide可減輕H/R條件下H9c2心肌細(xì)胞損傷;其抗凋亡作用可能與抑制線粒體凋亡通路有關(guān)。
　　第二部分:Exenatide對H/R條件下H9c2心肌細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用

6、
　　目的:探討Exenatide對H/R條件下H9c2心肌細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用。
　　方法:建立H9c2心肌細(xì)胞H/R模型。Exenatide(200 nM)預(yù)處理后，透射電鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化;激光共聚焦及流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)、活性氮(reactive nitrogenspecies，RNS)、線粒體鈣離子(Ca2+m)、線粒體膜電位（△Ψm）及線粒體通

7、透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開關(guān)狀態(tài);分光光度計檢測細(xì)胞總超氧化物歧化酶(total superoxide Dismutase, T-SOD)，丙二醛(maleic dialdehyde, MDA)和線粒體ATPase活性;酶標(biāo)儀測細(xì)胞ATP水平。
　　結(jié)果:①與Control組相比，H/R組線粒體及線粒體嵴水腫增加，密度降低，呈空泡化;線粒體ROS(158.92±10.78 vs98.57±6.03)和RNS(128.50±6.35

8、vs100.13±11.63)生成顯著增加（P＜0.05）;Ca2+m水平（148.48±5.93 vs85.85±4.91）顯著升高(P＜0.05);△Ψm(0.60±0.09 vs1.97±0.03)顯著降低(P＜0.05); mPTP開放(573.87±50.78 vs864.64±46.65)顯著增加(P＜0.05);細(xì)胞ATP水平(3.49±0.54 vs12.25±3.12)顯著降低(P＜0.05); T-SOD和ATPas

9、e活性顯著降低(P＜0.05); MDA活性顯著增加（P＜0.05）。②與H/R組相比，Exenatide+H/R組線粒體及線粒體嵴水腫減輕，密度增加，空泡化程度減輕;線粒體ROS(126.43±12.89vs158.92±10.78)和RNS(113.85±4.97vs128.50±6.35)生成顯著減少(P＜0.05); Ca2+m水平(117.91±2.82 vs148.48±5.93)顯著降低（P＜0.05）;△Ψm(1.10±

10、0.06 vs0.6±0.09)顯著升高(P＜0.05); mPTP開放(676.92±48.27 vs573.87±50.78)顯著減少(P＜0.05);細(xì)胞ATP水平(7.04±0.98 vs3.49±0.54)顯著升高(P＜0.05); T-SOD和ATPase活性顯著升高(P＜0.05); MDA活性顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:Exenatide可改善H/R條件下H9c2心肌細(xì)胞的線粒體功能。
　　第三部分

11、:Exenatide對H/R條件下H9c2心肌細(xì)胞線粒體保護(hù)作用的機(jī)制
　　目的:探討Exenatide改善H/R條件下H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能的機(jī)制。
　　方法:建立H9c2心肌細(xì)胞H/R模型。給予GLP-1R/cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相應(yīng)抑制劑及激動劑預(yù)處理后，激光共聚焦及流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS、RNS、Ca2+m、△Ψm及mPTP開關(guān)狀態(tài);分光光度計檢測線粒體ATPase活性;酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞ATP水平;Wester

12、n blot檢測細(xì)胞蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、解耦聯(lián)蛋白-3(Uncouplingprotein-3，UCP-3)及核呼吸因子-1(Nuclear respiratory factor-1，NRF-1)。
　　結(jié)果:①與Exenatide+H/R組相比，Exendin-(9-39)組、Rp-cAMPS組和H-89組線粒體ROS和RNS生成顯著增加(P＜0.05);Ca2+m水平顯著升高（P＜0.05）

13、;△Ψm顯著降低(P＜0.05);mPTP開放顯著增加（P＜0.05）;細(xì)胞ATP水平顯著降低(P＜0.05); ATPase活性顯著降低（P＜0.05）。②與Exenatide+H/R組相比，F(xiàn)orskolin組上述指標(biāo)與Exenatide+H/R組相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。③與Control組相比，H/R組H9c2心肌細(xì)胞PKA、UCP-3和NRF-1表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);與H/R組相比，Exenatide

14、+H/R組心肌細(xì)胞PKA、UCP-3和NRF-1表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05）;Forskolin組上述指標(biāo)與Exenatide+H/R組相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）;④與Exenatide+H/R組相比，Exendin-(9-39)組、Rp-cAMPS組和H-89組H9c2心肌細(xì)胞PKA、UCP-3和NRF-1表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:Exenatide改善H/R條件下H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能的