參附注射液預(yù)處理對(duì)缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞延遲性保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究參附注射液預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的延遲保護(hù)作用的量效、時(shí)效關(guān)系并探討其可能機(jī)制。 方法：本實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細(xì)胞，建立細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。采用細(xì)胞存活率和凋亡率(流式細(xì)胞術(shù))、培養(yǎng)液中LDH活性(細(xì)胞LDH漏出率，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定)、細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA活性(細(xì)胞MDA漏出率，硫代巴比妥鈉比色法)作為細(xì)胞受損指標(biāo)，觀察終濃度為1 00、200、400ul/ml的參附注射液預(yù)處理以及預(yù)處理6、12、

2、24、48、72、96h后對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響，并同時(shí)觀察ERKs上游激酶MEK-1/2抑制劑PD098059及反義HW-1α對(duì)參附注射液預(yù)處理誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞延遲性保護(hù)作用及其誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)的影響。具體實(shí)驗(yàn)分組如下： 1．參附注射液預(yù)處理對(duì)缺氧，復(fù)氧心肌細(xì)胞的延遲保護(hù)作用的量效關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究：培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)進(jìn)入各實(shí)驗(yàn)分組：①空白對(duì)照(Control)組：細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)28(2+24+2)h；②缺氧/復(fù)

3、氧(H/R)組：細(xì)胞缺氧2h后復(fù)氧，常氧培養(yǎng)2h：③缺氧預(yù)處理(HPC)組：細(xì)胞缺氧20min，復(fù)氧后置培養(yǎng)箱內(nèi)常氧培養(yǎng)24h，然后再進(jìn)行H/R操作；④～⑥100ul/ml、200ul/ml、400ul/ml參附注射液預(yù)處理(SF-100、SF-200、SF-400)組：含不同濃度(100ul/ml、200ul/ml、400ul/ml)參附注射液的無(wú)血清培養(yǎng)基預(yù)孵育細(xì)胞10min，更換預(yù)平衡的無(wú)血清培養(yǎng)基后置培養(yǎng)箱內(nèi)常氧培養(yǎng)24h，然后

4、進(jìn)行H/R操作。 2．參附注射液預(yù)處理對(duì)缺氧，復(fù)氧心肌細(xì)胞的延遲保護(hù)作用的時(shí)效關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究：采用實(shí)驗(yàn)1確定的最佳預(yù)處理濃度(200ul/ml)，按如下分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：①Control組，②H/R組，③HPC組，④～⑨參附注射液預(yù)處理后6h、12h、24h、48h、72h、96h缺氧/復(fù)氧(SF-6、SF-12、SF-24、SF-48、SF-72、SF-96)組。 3．反義HIF-1α及ERK通路抑制劑PD098059對(duì)參

5、附注射液預(yù)處理誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞延遲性保護(hù)作用的影響的實(shí)驗(yàn)研究：采用實(shí)驗(yàn)1確定的最佳預(yù)處理濃度(200ul/ml)預(yù)處理心肌細(xì)胞并在實(shí)驗(yàn)2確定的最佳保護(hù)作用時(shí)段(預(yù)處理后12h)內(nèi)進(jìn)行H/R操作，具體分組如下：①Control組，②H/R組，③HPC組，④參附注射液預(yù)處理(SF)組，⑤參附注射液+反義HIF-1a(SF+iHIF-la)組：參附注射液預(yù)處理前用含5.0umol/L的反義HIF-1a培養(yǎng)基預(yù)孵育細(xì)胞lOmin，其余步驟同④；⑥

6、參附注射液+PD098059(SF+PD098059)組：參附注射液預(yù)處理前用終濃度為50μmol/L的PD098059預(yù)孵育細(xì)胞10min，其余步驟同④。?、佗邰堍藿M細(xì)胞進(jìn)行Western Blot檢測(cè)心肌細(xì)胞HIE-la蛋白表達(dá)量。 結(jié)果：1.與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞存活率降低34.20％而凋亡率增加22.15％(p<0.05)，LDH和MDA漏出率分別增加110.26％、51.22％(p<0.05)。而HPC組與H/R組

7、相比，細(xì)胞存活率增加22。16％，凋亡率降低11.34％(p<0.05)，LDH和MDA漏出率分別減少70.77％、37.43％(p<0.05)。2.100、200、400ul/ml濃度參附注射液預(yù)處理組較H/R組相比，細(xì)胞存活率分別增加5.90％、20.20％、20.86％(p<0.05)，凋亡率分別降低8.29％、8.59％、8.44％(p<0.05)，LDH和MDA漏出率分別減少34.52％、58。50％、52。74％和27.72

8、％、33。7l％、31.25％(p<0.05)。其中100ul/ml參附注射液預(yù)處理組與H/R組比較無(wú)顯著性差異(p>0.05)，200、400ul/ml參附注射液預(yù)處理組與H/R組相比有顯著性差異(p<0.05)，但與HPC組及二者之間并無(wú)顯著性差異(p>0.05)。3.SF-6、SF-12、SF-24、SF-36、SF-48、SF-72參附注射液預(yù)處理組較H/R組相比，細(xì)胞存活率分別增加5.14％、15.75％、20.20％、20.

9、52％、19.66％、17.81％而凋亡率分別降低4.82％、10.80％、8.59％、8.74％、7.68％、8.26％(p<0.05)，LDH和MDA漏出率分降低34。32％、43.26％、58.50％、57.63％、59.92％、58.29％和20.47％、30.38％、33.69％、30.83％、3 1.78％、29.75％(p<0.05)。除SF-6組與HPC組相比有顯著性差異外(p>0.05)，其余各組與HPC組相比無(wú)顯著性

10、差異且組間無(wú)顯著性差異(p<0.05)。4.HPC組、sF組與H/R組相比，細(xì)胞存活率分別增加22.16％、20.20％，凋亡率分別降低11.34％、8.59％，LDH和MDA漏出率分別減少70.77％、58.50％和37.43％、33.71％，此兩組結(jié)果與H/R組相比有顯著差異(p<0.05)且此兩組間差異無(wú)顯著性(p>0.05)。而SF組+反義HIF-lα組、SF組+PD098059組與H/R組相比，細(xì)胞生存率分別增加6.04％、7

11、.89％而凋亡率分別減少4.59％、5.41％，LDH和MDA漏出率較H/R組分別減少10.91％、17.69％和11.76％、12.57％，結(jié)果無(wú)顯著差異(p>0.05)；但此兩組與HPC組相比，細(xì)胞生存率分別減少16.12％、14.27％，LDH和MDA漏出率較H/R組分別增加59.86％、53.08％和24.67％、23.86％，結(jié)果有顯著性差異(p<0.05)。5.Western Blot結(jié)果顯示：對(duì)照組HIF-1α所在的120

12、kD蛋白條帶灰度值為0.427，HPC組為0.837，SF組為0.783，后二組較對(duì)照組分別高0.410和0.356(p<0.01)，且后二組間無(wú)顯著性差異(p<0.01)，而PD098059組HIF-1α表達(dá)(灰度值為0.566)與SF組及HPC組相比則明顯受到抑制(p<0.05). 結(jié)論：1.參附注射液預(yù)處理可以模擬缺氧預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞延遲性保護(hù)作用； 2.200μl/ml的參附注射液預(yù)處理即可誘導(dǎo)對(duì)缺氧/復(fù)氧