羥基紅花黃素A對缺氧-復氧誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響及機制研究.pdf

1、背景：隨著心臟移植、冠狀動脈搭橋以及經(jīng)皮冠脈介入等治療手段廣泛地應(yīng)用于臨床，心肌缺血再灌注損傷已成為臨床上常見的一種病理生理現(xiàn)象。細胞凋亡在心肌缺血后即觸發(fā)并因再灌注而加重，減少缺血和再灌注過程中心肌細胞凋亡可以挽救更多的心肌，提高心肌缺血后再灌注治療的效果。血紅素氧合酶1(HO-1)，是血紅素氧合酶的誘導型，研究表明HO-1被誘導適應(yīng)性表達能發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。多種因素可通過信號轉(zhuǎn)導通路ERK1/2或PI3K/Akt激活并促使紅細胞

2、系核因子-2相關(guān)因子-2(Nrf2)向核內(nèi)轉(zhuǎn)位、并與細胞核內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)上相應(yīng)位點相互作用，上調(diào)HO-1的表達與酶活力，減輕各種應(yīng)激狀態(tài)下組織細胞的損傷。羥基紅花黃素A(HSYA)是藥用植物紅花的最主要的有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，HSYA可以減輕組織細胞的缺血再灌注損傷，可以抑制低氧誘導的內(nèi)皮細胞凋亡。目前尚未見到有關(guān)HSYA對缺血再灌注過程中心肌細胞凋亡的影響及其機制的研究報道。本研究探討了HSYA對缺氧/復氧誘導的H9c2心肌

3、細胞凋亡的影響及其分子機制，分兩部分進行。
　　 第一部分：羥基紅花黃素A上調(diào)血紅素氧合酶-1的表達抑制缺氧/復氧誘導的H9c2心肌細胞凋亡
　　 目的：利用體外細胞缺氧/復氧(A/R)模擬體內(nèi)組織細胞缺血再灌注誘導H9c2心肌細胞凋亡，給予HSYA干預，探討其對A/R誘導的心肌細胞凋亡的影響和其分子機制。
　　 方法：H9c2心肌細胞隨機分為對照組、A/R組、A/R并給予不同劑量(1、5、20、80μM)HSY

4、A干預組，MTT法檢測各組H9c2心肌細胞活力，酶聯(lián)免疫分析法檢測各組H9c2心肌細胞上清液肌鈣蛋白Ⅰ濃度，蛋白免疫印跡技術(shù)測定各組H9c2心肌細胞HO-1蛋白表量。然后用隨機分成的對照組、A/R組、A/R并給予HSYA20μM干預組、HO-1抑制劑(ZnPP-Ⅸ)組繼續(xù)進一步的實驗，測定各組H9c2心肌細胞的HO-1酶活力，F(xiàn)ITC-Annexin V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測各組H9c2心肌細胞的凋亡率，蛋白免疫印跡技術(shù)測定各組H9c

5、2心肌細胞HO-1蛋白表量、裂解的caspase-3(CC3)表達量和細胞線粒體Bcl-2/Bax比值。
　　 結(jié)果：⑴HSYA提高了經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞的活力。⑵HSYA減輕了經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞的損傷。⑶HSYA上調(diào)了經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞的HO-1表達。⑷ZnPP-Ⅸ對HSYA上調(diào)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞的HO-1表達的作用沒有明顯影響。⑸HSYA上調(diào)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞HO-1的酶活力被

6、ZnPP-Ⅸ抑制。⑹HSYA抗A/R誘導H9c2心肌細胞凋亡的作用被ZnPP-Ⅸ部分消除。⑺ZnPP-Ⅸ部分地消除了HSYA上調(diào)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞線粒體Bcl-2/Bax比值的作用。⑻ZnPP-Ⅸ部分地消除了HSYA降低經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞CC3表達量的作用。
　　 結(jié)論：HSYA通過上調(diào)HO-1的表達量和酶活力抑制A/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡從而減輕了細胞損傷。
　　 第二部分：羥基紅花黃素A上調(diào)

7、經(jīng)歷缺氧/復氧的H9c2心肌細胞血紅素氧合酶-1的表達的信號轉(zhuǎn)導通路。
　　 目的：利用體外A/R模擬體內(nèi)缺血再灌注誘導H9c2心肌細胞凋亡，并給予HSYA干預，探討HSYA在抗A/R誘導的心肌細胞凋亡作用中上調(diào)HO-1表達的細胞信號轉(zhuǎn)導通路機制。
　　 方法：H9c2心肌細胞隨機分為對照組、A/R組、HSYA20μM干預組、HO-1抑制劑組，蛋白免疫印跡技術(shù)測定各組H9c2心肌細胞p-ERK1/2、p-Akt蛋白表量。

8、然后用隨機分成的對照組、A/R組、HSYA20μM干預組、PI3K抑制劑(LY294002)組繼續(xù)進一步的實驗，蛋白免疫印跡技術(shù)測定各組H9c2心肌細胞p-Akt、HO-1、CC3蛋白表量和各組H9c2心肌細胞核蛋白中Nrf2的量。
　　 結(jié)果：⑴HSYA和ZnPP-Ⅸ對經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞的ERK1/2的磷酸化沒有明顯影響。⑵HSYA促進經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞Akt磷酸化而ZnPP-Ⅸ對HSYA增強H9c2心肌細

9、胞Akt磷酸化的作用沒有明顯影響。⑶HSYA促進經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞Akt磷酸化的作用被LY294002阻斷。⑷LY294002部分地阻斷了HSYA上調(diào)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞HO-1表達的作用，并顯著地削弱了HSYA降低經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞CC3表達量的作用。⑸HSYA促進經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細胞Nrf2向核內(nèi)轉(zhuǎn)位的作用被LY294002部分阻斷。
　　 結(jié)論：HSYA減輕細胞損傷可能機制之一是通過激活