雷公藤紅素對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及其可能相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：缺血性心臟病是目前威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)疾病之一，且具有較高的致死率。當(dāng)心肌缺血發(fā)生后，及時(shí)對(duì)缺血心肌進(jìn)行血液再灌注治療是目前減少心肌細(xì)胞壞死最有效的途徑，然而再灌注技術(shù)的應(yīng)用在挽救心肌的同時(shí)也造成了心肌的損傷，即心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）。因此，如何有效的預(yù)防和減輕MIRI，成為了再灌注療法治療缺血性心臟病亟待解決的問(wèn)題。目前，無(wú)論是在體實(shí)驗(yàn)還是體外

2、實(shí)驗(yàn)研究都表明MIRI的發(fā)生與多種機(jī)制有關(guān)。氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、離子通道異常、血小板激活引起微血栓形成、冠狀動(dòng)脈內(nèi)功能紊亂等均參與了MIRI的發(fā)生。針對(duì)MIRI的治療國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼提出了缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IPC)和缺血后適應(yīng)（ischemic postconditioning，IPoC）療法，但鑒于在臨床實(shí)際工作中，二者實(shí)踐起來(lái)仍面臨著一定困難，操作復(fù)雜，且與醫(yī)學(xué)倫理學(xué)不符，因此尋找新的藥物預(yù)

3、防和減輕MIRI更為切合臨床。雷公藤紅素(celastrol)，來(lái)源于中藥雷公藤的根皮，為雷公藤的三萜單體成分。大量研究表明，雷公藤紅素具有多種藥理作用，包括抗氧化，抗炎癥，抗腫瘤以及調(diào)控肥胖的作用。近期一項(xiàng)研究指出，雷公藤紅素對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，而雷公藤紅素對(duì)MIRI是否具有的保護(hù)仍然是未知的。因此我們?cè)O(shè)想:雷公藤紅素通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)，緩解IL-1β、TNF-a炎癥因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而減輕MIRI。為了驗(yàn)

4、證該假設(shè)，我們利用大鼠H9C2細(xì)胞行缺氧復(fù)氧，模擬MIRI模型，研究雷公藤紅素對(duì)MIRI的保護(hù)作用及其可能相關(guān)機(jī)制。
　　方法：⑴研究雷公藤紅素預(yù)處理對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響。首先取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為7組:正常對(duì)照組(Control組)、缺氧復(fù)氧組(H/R組)，根據(jù)缺氧復(fù)氧的時(shí)間不同分為H4hR2h組、H6hR3h組、H8hR4h組、H12hR5h組、H16hR6h組、H20hR8h組;顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)

5、，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，確定缺氧復(fù)氧模型;然后實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為8組:正常對(duì)照組(Control組)、缺氧復(fù)氧組（H瓜組）、缺氧復(fù)氧+雷公藤紅素預(yù)處理組(H/R+Cel組)，根據(jù)雷公藤紅素不同分為Cel1(10nM)、Cel2(20nM)、Cel3(50nM)、Cel4(100nM)、Cel5(200nM)、Cel6(400nM)組，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，確定最佳藥物劑量組;利用最佳藥物劑量，將實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(Control組)、雷

6、公藤紅素預(yù)處理組(Celastrol組)、缺氧復(fù)氧組(H/R組)、缺氧復(fù)氧+雷公藤紅素預(yù)處理組(H/R+Celastrol組)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT測(cè)細(xì)胞活性，檢測(cè)LDH評(píng)估細(xì)胞損傷程度。⑵雷公藤紅素預(yù)處理對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用的可能相關(guān)機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組:Control組、Celastrol組、H/R組、H/R+Celastrol組，Western blot檢測(cè)IL-1β、TNF-a、NF-κ B

7、蛋白表達(dá)情況，Realtime PCR檢測(cè)IL-1β、TNF-a、NF-κBmRNA的相對(duì)表達(dá)情況。⑶統(tǒng)計(jì)方法:獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于兩組間比較，多個(gè)樣本比較時(shí)采用單因素方差分析;P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①雷公藤紅素預(yù)處理對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷發(fā)揮保護(hù)作用。MTT結(jié)果顯示隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活性降低。與Control組比H6hR3h細(xì)胞存活率為80.066±2.130％，H8hR4h的細(xì)胞存活率為69.

8、716±1.303％，為進(jìn)行后續(xù)藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇H8hR4h構(gòu)建細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型。用不同劑量的雷公藤紅素(0nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、400nM)預(yù)處理細(xì)胞，1h后進(jìn)行缺氧8h復(fù)氧4h處理;雷公藤紅素50nM細(xì)胞存活率最高為81.931±2.157％，選擇此濃度為最佳劑量。LDH測(cè)定結(jié)果顯示:與H/R組相比，H/R+Celastrol組細(xì)胞存活率升高，LDH釋放量顯著降低(P＜0.001)。②雷公藤紅

9、素預(yù)處理對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用的可能相關(guān)機(jī)制研究。Realtime PCR及Western blot結(jié)果顯示H/R+Celastrol組與H/R組相比IL-1β、TNF-amRNA及蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)。H/R+Celastrol組與H/R組相比發(fā)現(xiàn)，NF-κ BmRNA表達(dá)降低(P＜0.001)，胞漿內(nèi)NF-κβ蛋白表達(dá)增加（P=0.035），核內(nèi)NF-κβ蛋白表達(dá)降低(P=0.047)。
　　結(jié)論：低