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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
研究薯蕷皂苷(dioscin,Dio)對(duì)大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用機(jī)制。
方法:
建立大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型,并用薯蕷皂苷進(jìn)行干預(yù)。將培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組,正常對(duì)照組(C組);缺氧/復(fù)氧模型組(H/R組);缺氧/復(fù)氧模型+薯蕷皂苷低、中、高劑量(10mg/L、20 mg/L、40mg/L)干預(yù)組(H/R+L、M、H組)。
2、1.用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法測(cè)定細(xì)胞存活率。
2.收集培養(yǎng)細(xì)胞上清液,分別測(cè)定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量。
3.應(yīng)用熒光探針DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的活性氧(reactive oxy
3、gen species,ROS),熒光顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。
4.采用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
5.用羅丹明123((Rhodamine123,Rh123)熒光探針標(biāo)記線粒體,多功能標(biāo)記儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度以反映細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的變化。
6.采用酶聯(lián)免
4、疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt-c)釋放量。
7.應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、caspase-9、caspase-3mRNA的表達(dá)。
8.應(yīng)用Western blot法檢測(cè)熱休克蛋白70(heat-shock protein70,HSP70)的表達(dá)。結(jié)果
5、 1.細(xì)胞存活率:與H/R組比較,C組心肌細(xì)胞存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(34.50±8.50%vs100.00±00.00%,P<0.01),H/R+L、M、H三組,均可明顯升高心肌細(xì)胞存活率(34.50±8.50%vs66.47±10.56%,76.19±7.57%,93.38±6.09%,P<0.01);且與H/R+H組比較,H/R+L、M組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
2.LDH活性:與H/R組比較,C組心肌細(xì)胞L
6、DH活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1287.68±58.97 U/L vs975.29±35.66 U/L,P<0.01),H/R+L、M、H三組,均可明顯降低心肌細(xì)胞LDH活性(1287.68±58.97 U/L vs1150.85±40.67 U/L,1078.79±48.94 U/L,1001.65±53.05 U/L,P<0.01);且與H/R+H組比較,H/R+L、M組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
SOD活性:與H/R組比
7、較,C組心肌細(xì)胞SOD活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(17.36±1.12 U/mlvs23.55±1.19 U/ml.P<0.01),H/R+L、M、H三組,均可明顯升高心肌細(xì)胞SOD活性(17.36±1.12 U/ml vs19.59±0.60 U/ml,21.08±0.63 U/ml,22.56±0.59 U/ml,P<0.01);且與H/R+H組比較,H/R+L組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
MDA含量:與H/R組比較,C組心
8、肌細(xì)胞MDA含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2.88±0.04 nmol/ml vs2.49±0.03 nmol/ml,P<0.01),H/R+L、M、H三組,均可明顯降低心肌細(xì)胞MDA含量(2.88±0.04 nmol/ml vs2.72±0.06 nmol/ml,2.66±0.05nmol/ml.2.59±0.03 nmol/ml,P<0.01);且與H/R+H組比較,H/R+L、M組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
3.活性氧:熒光
9、顯微鏡下,Rosup活性氧陽(yáng)性對(duì)照組熒光強(qiáng)度最高,H/R組熒光強(qiáng)度較高,與H/R組比較,H/R+L、H/R+M、H/R+H組均可降低細(xì)胞熒光強(qiáng)度、減低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。
4.細(xì)胞凋亡率:與H/R組比較,C組心肌細(xì)胞凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(10.61±1.00%vs0.15±0.04%,P<0.01),H/R+L、M、H三組,均可明顯減低心肌細(xì)胞凋亡率(10.61±1.00%vs2.03±0.06%,1.80±0.06%,1.6
10、7±0.04%,P<0.01);且與H/R+H組比較,H/R+L、M組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.01)。
5.△Ψm熒光強(qiáng)度:與H/R組比較,C組心肌細(xì)胞線粒體膜電位有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(106547±5907 vs205486±4653,P<0.01),H/R+L、M、H三組,均可明顯升高心肌細(xì)胞線粒體膜電位(106547±5907vs160835±3521,186350±3353,194694±3043,P<0.01
11、);且與H/R+H組比較,H/R+L、M組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
6.Cyt-c釋放量:與H/R組比較,C組細(xì)胞內(nèi)Cyt-c量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),薯蕷皂苷干預(yù)的三組H/R+L、H/R+M、H/R+H組,均可減少心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)Cyt-c釋放量(P<0.01);與H/R+H組比較,H/R+L組(P<0.05),各給藥組的作用呈顯著濃度相關(guān)性。
7.Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá):與H
12、/R組比較,C組細(xì)胞Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),薯蕷皂苷干預(yù)的三組H/R+L、H/R+M、H/R+H組,均可減少心肌細(xì)胞Bax mRNA的表達(dá)(P<0.01),并能升高Bcl-2 mRNA的表達(dá)(P<0.05);與H/R+H組比較,H/R+L組(P<0.05),各給藥組的作用呈顯著濃度相關(guān)性。
caspase-9、caspase-3 mRNA的表達(dá):與H/R組比較,C組細(xì)胞casp
13、ase-9、caspase-3 mRNA的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),薯蕷皂苷干預(yù)的三組H/R+L、H/R+M、H/R+H組,均可減少心肌細(xì)胞caspase-9、caspase-3 mRNA的表達(dá)(P<0.01);與H/R+H組比較,H/R+L組(P<0.01),各給藥組的作用呈顯著濃度相關(guān)性。
8.HSP70的表達(dá):與H/R組比較,C組細(xì)胞HSP70的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),薯蕷皂苷干預(yù)的三組
14、H/R+L、H/R+M、H/R+H組,均可明顯升高心肌細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)(P<0.05);與H/R+H組比較,H/R+L組(P<0.01),各給藥組的作用呈顯著濃度相關(guān)性。
結(jié)論:
1.薯蕷皂苷可有效減少缺氧/復(fù)氧損傷的大鼠H9c2心肌細(xì)胞LDH漏出量,提高細(xì)胞存活率。
2.薯蕷皂苷可通過(guò)抗氧化作用有效保護(hù)缺氧/復(fù)氧對(duì)大鼠H9c2心肌細(xì)胞的損傷。
3.薯蕷皂苷可通過(guò)抗凋亡作用有
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