積雪草酸通過(guò)激活A(yù)kt-GSK-3β-HIF-1α信號(hào)通路保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞H9c2的缺氧-復(fù)氧損傷.pdf

1、目的：
　　心肌缺血/再灌注損傷是指由冠狀動(dòng)脈血液供應(yīng)不足繼而復(fù)灌引起的心肌細(xì)胞不可逆損傷，目前尚無(wú)有效的治療方法。積雪草酸是一種來(lái)源于熱帶藥用植物積雪草的五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具有廣泛的生物活性。在本研究中，我們通過(guò)體外建立大鼠 H9c2心肌細(xì)胞氧糖剝奪/再灌注（OGD/R）損傷模型，來(lái)模擬體內(nèi)心肌缺血再灌注損傷，觀察積雪草酸對(duì)H9c2細(xì)胞OGD/R損傷的保護(hù)作用，并在此基礎(chǔ)上探討其心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制，以期為治療心肌缺血/再灌注

2、損傷提供新的潛在藥物。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.心肌細(xì)胞OGD/R損傷模型的制備：使用不同濃度的積雪草酸（0.1,1,10,100μM）預(yù)處理體外培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞4 h，然后缺氧1 h，復(fù)氧12 h制備心肌細(xì)胞損傷模型，通過(guò)MTT和LDH漏出率檢測(cè)觀察不同濃度積雪草酸對(duì)H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　2.采用Hoechst33258熒光染料染色，觀察積雪草酸（10μM）對(duì)OGD/R損傷模型心肌細(xì)胞凋亡的影響；檢測(cè)各

3、組心肌細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性；Western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)。
　　3.使用2′,7′-二氯熒光素（dichlorofluorescein，DCF）檢測(cè)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量；應(yīng)用Fluo-3 AM熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度；應(yīng)用JC-1染料測(cè)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位，以此評(píng)價(jià)積雪草酸對(duì)OGD/R損傷后心肌細(xì)胞線粒體功能的影響。
　　4.采用Western blot

4、方法分析OGD/R處理后Akt、磷酸化Akt、GSK-3β、磷酸化GSK-3β和HIF-1α等蛋白的表達(dá)變化以及積雪草酸的干預(yù)作用；并結(jié)合用Akt抑制劑MK2206和HIF-1α抑制劑2-ME，試圖闡明積雪草酸的心肌細(xì)胞保護(hù)作用的可能分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.0.1-10μM積雪草酸對(duì)正常條件下H9c2細(xì)胞活力沒(méi)有影響，但可有效對(duì)抗OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，并呈濃度依賴(lài)性。
　　2.10μM積雪草酸可明顯

5、減少OGD/R損傷誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性，阻止缺氧條件下Bax上調(diào)和Bcl-2下調(diào)。
　　3.10μM積雪草酸可顯著減少OGD/R損傷誘導(dǎo)的活性氧過(guò)量產(chǎn)生，抑制線粒體膜電位降低，阻止鈣離子的釋放，有效改善缺氧條件下的線粒體功能。
　　4.積雪草酸可顯著上調(diào)OGD/R損傷后的磷酸化Akt和磷酸化GSK-3β水平，增加HIF-1α表達(dá)；使用Akt抑制劑MK2206和HIF-1α