HIF-1對(duì)H9c2心肌細(xì)胞新基因Mipu1表達(dá)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是調(diào)節(jié)與缺氧反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的最重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1由組成型表達(dá)的α和β兩個(gè)亞單位構(gòu)成，其α亞單位（HIF-1α）為HIF-1的活性亞基和調(diào)節(jié)亞基。研究表明，采用氯化鈷（cobalt chloride，CoCl2）誘導(dǎo)或HIF-1α基因轉(zhuǎn)染等使HIF-1α表達(dá)上調(diào)的方法可保護(hù)心肌免于缺血或缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，

2、I/R）引起的損傷。并且越來(lái)越多的證據(jù)表明，HIF-1參與了缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning，IP）對(duì)心肌的保護(hù)作用。HIF-1調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞在缺血/再灌注過(guò)程生存的機(jī)制目前還不十分清楚，可能與其激活心肌保護(hù)相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。Mipu1是我室采用大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)動(dòng)物模型篩選到的一個(gè)新基因，命名為心肌缺血預(yù)適應(yīng)表達(dá)上調(diào)蛋白（Myocardial ischemic preconditioning upregul

3、ated protein1，Mipu1，又名Znf667），該基因是一個(gè)鋅指型核轉(zhuǎn)錄抑制因子。采用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在Mipu1的啟動(dòng)子區(qū)含有一個(gè)HIF-1保守的缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response element，HRE），提示HIF-1可能是Mipu1的上游調(diào)控因子。本研究旨在首次探討HIF-1對(duì)新基因Mipu1表達(dá)的影響并揭示其可能的調(diào)控機(jī)制。 本課題以大鼠胚胎心臟來(lái)源的H9c2心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，將H9c2細(xì)

4、胞隨機(jī)分成5個(gè)組：（1）對(duì)照組（Ctrl）：以PBS（phosphate buffer solution）處理細(xì)胞；（2）CoCl2組（Co）：以200μmol/L CoCl2處理細(xì)胞12h；（3）空載體組（Neo）：以pEF-BOS空載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；（4）HIF-1α過(guò)表達(dá)組（HIF）：以表達(dá)人HIF-1α全長(zhǎng)的質(zhì)粒pEF-BOS-HIF-1α瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；（5）HIF-1α過(guò)表達(dá)加CoCl2組（HIF+Co）： HIF-1α過(guò)表達(dá)

5、質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，同時(shí)以200μmol/L CoCl2處理細(xì)胞12h。采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）觀察H9c2細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)情況；進(jìn)一步的機(jī)制研究，采用間接免疫熒光技術(shù)觀察HIF-1α蛋白在H9c2細(xì)胞的分布及表達(dá)情況；然后以RT-PCR和Western Blot觀察HIF-1α表達(dá)上調(diào)對(duì)Mipu1表達(dá)的影響；采用熒

6、光素酶報(bào)告基因檢測(cè)HIF-1α表達(dá)上調(diào)對(duì)Mipu1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響；采用凝膠電泳遷移率分析（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）及supershift觀察HIF-1是否與Mipu1啟動(dòng)子區(qū)的HRE直接結(jié)合。 結(jié)果顯示： （1）CoCl2組HIF-1α mRNA水平?jīng)]有明顯變化（p>0.05 vs Ctrl），HIF-1α過(guò)表達(dá)組HIF-1α mRNA水平明顯增高（p<

7、0.05 vs Neo），HIF-1α過(guò)表達(dá)加CoCl2組HIF-1α mRNA的水平?jīng)]有明顯變化（p>0.05 vsHIF）； （2）對(duì)照組HIF-1α蛋白分布于H9c2細(xì)胞的胞漿及胞核。CoCl2組、HIF-1α過(guò)表達(dá)組及兩者聯(lián)合處理組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)均明顯增多，并且由細(xì)胞漿向細(xì)胞核移位； （3）CoCl2組和HIF-1α過(guò)表達(dá)組Mipu1 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯增高（p<0.05，Co vs Ctr

8、l， p<0.05，HIF vs Neo），HIF-1α過(guò)表達(dá)加CoCl2組Mipu1的表達(dá)沒有明顯變化（p>0.05 vs HIF）； （4）CoCl2組和HIF-1α過(guò)表達(dá)組Mipu1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性均明顯增高（p<0.01，Co vs Ctrl； p<0.01，HIF vs Neo），HIF-1α過(guò)表達(dá)加CoCl2組的Mipu1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性沒有明顯變化（p>0.05 vs HIF）； （5）HIF-1可直接與M