miR-27b對(duì)大鼠H9C2心肌細(xì)胞中MCP-1表達(dá)的抑制作用.pdf

1、背景:
　　病毒性心肌炎(VMC)是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)IL-17可上調(diào)小鼠心肌細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)，而MCP-1介導(dǎo)的VMC小鼠單個(gè)核細(xì)胞的遷移是VMC心肌組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的重要機(jī)制之一。microRNA可以通過(guò)與靶mRNAs的3'-UTR末端的特定位點(diǎn)相結(jié)合，限制靶mRNAs翻譯或誘導(dǎo)該mRNA降解，從而參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。本研究利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)MCP-1可能為

2、miR-27b的靶基因，通過(guò)進(jìn)一步研究大鼠H9C2心肌細(xì)胞中miR-27b對(duì)IL-17誘導(dǎo)下MCP-1表達(dá)的影響作用，探討miR-27b是否可以下調(diào)MCP-1的表達(dá)。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組:傳代培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞株，按以下三種方式分組。
　　(1)在研究IL-17對(duì)MCP-1表達(dá)的影響中分6組，包括50ng/mlIL-17分別處理0h、2h、4h、8h、12h、24h的6個(gè)時(shí)效組。
　　(2)轉(zhuǎn)染miR

3、-27b類似體(mimics)后H9C2細(xì)胞中miR-27b的分析，包括轉(zhuǎn)染miR-27bmimics組、轉(zhuǎn)染miRNAmimics陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。
　　(3)在研究miR-27b對(duì)IL-17誘導(dǎo)下MCP-1表達(dá)的影響中分4組，即miR-27bmimics干預(yù)組（轉(zhuǎn)染miR-27bmimics+IL-17組）、miRNA陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染miRNAmimics陰性對(duì)照+IL-17組）、IL-17組和空白對(duì)照組。
　　2

4、.利用siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑將miR-27bmimics轉(zhuǎn)染到H9C2細(xì)胞中。
　　3.采用SYBRgreen(I)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞中miR-27b和MCP-1基因的表達(dá)情況。
　　4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MCP-1蛋白的表達(dá)情況。
　　5.采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組計(jì)量資料之間的比較用單因素方差分析(OnewayANOVA

5、)，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.IL-17對(duì)H9C2細(xì)胞中MCP-1表達(dá)的影響:IL-17作用2h后MCP-1的基因表達(dá)量開(kāi)始升高，4h時(shí)達(dá)到高峰，之后開(kāi)始下降;MCP-1蛋白的表達(dá)量在IL-17作用2h后開(kāi)始升高，之后在4～24h逐漸升高。
　　2.轉(zhuǎn)染miR-27bmimics后H9C2細(xì)胞中miR-27b的分析:轉(zhuǎn)染miR-27bmimics組與轉(zhuǎn)染miRNAm

6、imics陰性對(duì)照組比較，miR-27b含量顯著升高;而轉(zhuǎn)染miRNAmimics陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，miR-27b含量無(wú)明顯改變。
　　3.miR-27b對(duì)IL-17誘導(dǎo)下MCP-1表達(dá)的影響:IL-17組與空白對(duì)照組比較，MCP-1mRNA和蛋白水平顯著升高(P＜0.05);IL-17組與miRNA陰性對(duì)照組比較，兩組的MCP-1mRNA和蛋白水平無(wú)顯著差異(P＞0.05);miR-27bmimics干預(yù)組與miRNA