過表達(dá)CIAPIN1對H9c2心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的影響.pdf

1、目的：
　　檢測細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡抑制因子1(cytokine induced apoptosis inhibitor1, CIAPIN1)過表達(dá)對H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)損傷的影響。
　　方法：
　　1.構(gòu)建CIAPIN1過表達(dá)重組慢病毒載體并建立其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞株
　　通過構(gòu)建包裝CIAPIN1過表達(dá)慢病毒載體，測定其滴度，將其轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)

2、胞，檢測轉(zhuǎn)染效率。提取總蛋白，Western Blot檢測CIAPIN1蛋白的表達(dá)，判定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。
　　2. CIAPIN1過表達(dá)對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的影響
　　實驗分組：CIAPIN1過表達(dá)陰性對照組(NC)，CIAPIN1過表達(dá)陰性對照缺氧/復(fù)氧組(NC+H/R)和CIAPIN1過表達(dá)缺氧/復(fù)氧組(CIAPIN1+H/R)。NC+H/R組和CIAPIN1+H/R組細(xì)胞經(jīng)歷缺氧4 h/復(fù)氧2 h。

3、應(yīng)用MTT法檢測H9c2細(xì)胞存活率，利用比色法來檢測細(xì)胞的上清液內(nèi)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)的活性；Hoechst33258染色液從形態(tài)學(xué)角度觀察細(xì)胞的凋亡情況；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)來檢測H9c2細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1．CIAPIN1過表達(dá)重組慢病毒載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 H9c2細(xì)胞株的建立
　　本實驗成功構(gòu)建了CIAPIN1過表達(dá)慢病毒載體，細(xì)胞的生長狀態(tài)良好，熒光視野

4、中可見大量的綠色熒光顆粒，CIAPIN1過表達(dá)慢病毒包裝成功。轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞之后，熒光表達(dá)效率超過95％。轉(zhuǎn)染72 h后，與NC組相比，CIAPIN1組表達(dá)量明顯升高(P<0.001)。
　　2．CIAPIN1過表達(dá)對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的影響
　　經(jīng)過缺氧4 h復(fù)氧2 h的處理之后，與NC組相比，NC+H/R和 CIAPIN1+H/R組細(xì)胞的存活率明顯下降(P<0.001)；與NC+H/R組相比，CIAPIN1

5、+H/R組細(xì)胞的存活率顯著升高(P<0.001)。與 NC組相比，NC+H/R組和 CIAPIN1+H/R組LDH活性均明顯升高(P<0.01)。但與NC+H/R組對比，CIAPIN1+H/R組LDH的漏出顯著減少(P<0.001)。用Hoechst33258染色后觀察到NC+H/R組可見細(xì)胞核固縮，濃染的情況明顯增多，呈細(xì)小不規(guī)則的顆粒狀，細(xì)胞碎片較多，而CIAPIN1+H/R組僅有部分細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮凝聚，可見致密濃染，細(xì)胞碎片較少。