DHA保護(hù)H9C2心肌細(xì)胞脂超載損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的：近年文獻(xiàn)報(bào)道2型糖尿?。╰ype2 diabetes mellitus，T2DM）患者數(shù)量呈逐年上升的趨勢(shì)，糖尿病相關(guān)心臟并發(fā)癥是2型糖尿病患者晚期最主要的死亡原因。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，食物中補(bǔ)充n-3系多不飽和脂肪酸（n-3 Polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFAs），可以對(duì)抗心肌肥大，改善心功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食并注射小劑量STZ（鏈脲佐菌素）誘導(dǎo)的2型糖尿病模型大鼠心肌 n-3

2、PUFAs二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量明顯下降，并伴有左心肥大，左心室心肌收縮功能明顯下降，而飲食中補(bǔ)充DHA的2型糖尿病大鼠上述情況均有所改善。
　　細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，與細(xì)胞壞死不同，凋亡涉及一系列基因的激活，表達(dá)及調(diào)控。前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)在整體水平2型糖尿病大鼠心肌內(nèi)細(xì)胞凋亡增加，飲食補(bǔ)充DHA的2型糖尿病大鼠細(xì)胞凋亡有所改善。但DHA及其它n-

3、3 PUFAs是否確可對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡，作用及機(jī)制又如何？需要在細(xì)胞水平進(jìn)行研究。
　　細(xì)胞骨架是指真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞骨架不僅在維持細(xì)胞形態(tài)，承受外力，保持內(nèi)部結(jié)構(gòu)有序性方面起重要作用，還參與許多重要的生命活動(dòng)。在心肌細(xì)胞中，細(xì)胞骨架和它的結(jié)合蛋白組成動(dòng)力系統(tǒng)。文獻(xiàn)報(bào)道，在心肌肥大和心力衰竭的動(dòng)物的心肌細(xì)胞中可見(jiàn)細(xì)胞骨架改變。前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠肌原纖維紋理模糊，纖維束排列不規(guī)則，出現(xiàn)斷裂溶解，補(bǔ)充DHA可阻

4、止T2DM大鼠心肌肌原纖維的斷裂和溶解。DHA等n-3 PUFAs確對(duì)心肌細(xì)胞骨架有什么影響嗎？需在細(xì)胞水平證實(shí)。
　　基于上述目的，本實(shí)驗(yàn)以H9C2大鼠心肌細(xì)胞株作為研究對(duì)象，給予高濃度軟脂酸模擬糖尿病心肌所處的高脂環(huán)境，造成細(xì)胞損傷后，補(bǔ)充DHA等n-3 PUFAs，觀察H9C2心肌細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞骨架改變，探究DHA的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　1.MTS實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)，確定可使細(xì)胞活力下降的C16:0

5、濃度以及DHA的保護(hù)濃度。
　　2.Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)的Cleaved Caspase3， Cleaved PARP，PARP和FADD蛋白表達(dá)。
　　3.Real time-RT PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase3，9，12，炎癥相關(guān)基因TNF-α以及氧化應(yīng)激相關(guān)基因HO-1等的mRNA表達(dá)量。
　　4.TUNEL法檢測(cè)不同濃度C16:0，不同濃度n-3系PUFAs以及不同濃度n-6系A(chǔ)

6、A處理后的細(xì)胞凋亡情況。
　　5.鬼筆環(huán)肽染色法觀察C16:0對(duì)H9C2心肌細(xì)胞骨架影響，以及給予DHA等n-3系PUFAs或者n-6系的AA后能否逆轉(zhuǎn)C16:0導(dǎo)致的細(xì)胞骨架的改變。
　　6.Western Blot檢測(cè)高C16:0對(duì)肌鈣蛋白TNNT2，肌鈣蛋白酶Calpain1，Calpain2，Calpain S1的蛋白量的影響，以及補(bǔ)充DHA后TNNT2， Calpain1，Calpain2，Calpain S1蛋白

7、量的變化。
　　7.Real time-RT PCR檢測(cè)補(bǔ)充DHA之后細(xì)胞Calpain1 mRNA表達(dá)量的變化。
　　8.結(jié)果數(shù)據(jù)以 x±SD表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間的差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.脂質(zhì)超載引起了H9C2心肌細(xì)胞的活力下降，DHA則可以改善脂質(zhì)超載損傷的細(xì)胞活力
　　給予150-400μmol/L濃度范圍

8、內(nèi)的C16:0處理細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞活性明顯低于BSA溶劑對(duì)照組（P<0.05），并且C16:0濃度越高H9C2心肌細(xì)胞活性越低。
　　單純 DHA處理細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞活性與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，但在C16:0200μmol/L基礎(chǔ)上補(bǔ)充10、100μmol/L DHA后，C16:0導(dǎo)致的細(xì)胞活力的下降得以改善。
　　2.C16:0引起的心肌細(xì)胞活力下降與氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的增加有關(guān)
　　隨著C16:0濃度的增加，

9、H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)因子HO-1和炎癥相關(guān)因子TNF-α的mRNA表達(dá)量明顯增加，表明C16:0引起的心肌細(xì)胞活力下降與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。
　　3.脂超載引起的細(xì)胞活力下降與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑介導(dǎo)的凋亡有關(guān)
　　C16:0處理H9C2細(xì)胞24小時(shí)后，隨著C16:0濃度的逐漸升高，細(xì)胞凋亡的數(shù)量也出現(xiàn)增加。與此同時(shí)，細(xì)胞凋亡關(guān)的Caspase3的mRNA表達(dá)量，以及Cleaved Caspase3和Cl

10、eaved PARP蛋白量明顯增加，而細(xì)胞壞死的標(biāo)志性蛋白 FADD的表達(dá)量卻沒(méi)有出現(xiàn)明顯變化，表明 C16:0引起心肌細(xì)胞活性降低主要是凋亡而不是壞死所致。因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的重要起始子Caspase12而不是細(xì)胞線粒體凋亡途徑的上游分子 Caspase9的mRNA表達(dá)量表達(dá)增加，表明C16:0超載引起的細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑有關(guān)。
　　4.DHA等n-3 PUFAs改善脂超載損傷的心肌細(xì)胞活力與其降低細(xì)胞凋亡有關(guān)
　　

11、給予200μmol/L16:0處理24小時(shí)后，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，但同時(shí)給予1、10、100μmol/L DHA、 EPA和LNA處理后，則可降低由C16:0上調(diào)的凋亡細(xì)胞的數(shù)量；DHA、EPA、LNA均可以逆轉(zhuǎn)C16:0導(dǎo)致的Cleaved Caspase3和Cleaved PARP蛋白量的增加。但是，n-6 PUFAs花生四烯酸AA本身卻可增加細(xì)胞凋亡。
　　5.脂超載引起H9C2心肌細(xì)胞活下降，與其引起心肌細(xì)胞細(xì)胞骨架改變有關(guān)

12、
　　隨著C16:0濃度增加，心肌細(xì)胞內(nèi)的肌絲增粗，折疊，致使細(xì)胞由規(guī)則的長(zhǎng)梭形變成有多處凹陷的不規(guī)則多邊形。隨著細(xì)胞肌絲形態(tài)的改變，細(xì)胞的肌鈣蛋白酶Calpain1，Calpain2和Calpain S1蛋白表達(dá)量增加，而肌鈣蛋白Troponin T(TNNT2)的蛋白量逐漸下降。表明C16:0超載引起的細(xì)胞活性下降與其肌鈣蛋白酶 Calpain表達(dá)增加，從而引起肌鈣蛋白Troponin T的降解，導(dǎo)致細(xì)胞骨架形態(tài)改變有關(guān)。

13、r>　　6.DHA等n-3 PUFAs能夠抑制脂超載引起的細(xì)胞骨架的改變，進(jìn)而改善脂超載所致的心肌細(xì)胞活力下降
　　給H9C2補(bǔ)充1、10、100μmol/L DHA、EPA和LNA后，可逆轉(zhuǎn)C16:0所致的H9C2細(xì)胞骨架改變。但是n-6 PUFA花生四烯酸AA本身即可造成細(xì)胞骨架翻折，并且隨著AA濃度的增加，形態(tài)異常細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。
　　給H9C2補(bǔ)充DHA能降低C16:0導(dǎo)致的肌鈣蛋白酶Calpain1，2，S1表達(dá)