艾塞那肽對H9c2心肌細胞葡萄糖攝取的影響及機制研究.pdf

1、第一部分：2-NBDG用于H9c2心肌細胞葡萄糖攝取的能力研究
　　目的：評估熒光標(biāo)記2-脫氧葡萄糖(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diaxol-4-y1)amino]-2-deoxyglucose，2-NBDG)作為光學(xué)探針檢測H9c2心肌細胞葡萄糖攝取的能力。
　　方法：間接免疫熒光法測定H9c2心肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運體(GLUT-1、GLUT-4)的表達；熒光酶標(biāo)儀測定2-NBDG孵育H9c2細胞

2、的最適濃度和時間。以2-NBDG最適濃度孵育H9c2心肌細胞，同時用共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測細胞內(nèi)熒光強度差異，觀察心肌細胞攝取2-NBDG情況。
　　結(jié)果：
　　(1)：接免疫熒光法顯示H9c2心肌細胞表達GLUT-1、GLUT-4。
　　(2)：2-NBDG孵育H9c2心肌細胞的最適濃度為100μmol/L和最適時間為30min。共聚焦成像和流式細胞儀均顯示H9c2心肌細胞能有效攝取2-NBDG：激光共聚焦掃描

3、成像顯示2-NBDG組細胞內(nèi)熒光信號(93.32±7.60)，2-NBDG+D-Glu組H9c2細胞內(nèi)熒光信號表達(68.51±3.56)，但較單純2-NBDG組熒光信號減弱27％(P<0.05)。流式細胞儀檢測2-NBDG組熒光強度為51.17±5.09；2-NBDG+D-Glu組熒光強度為27.27±2.48較單純2-NBDG組降低46.7％(P<0.01)。
　　(3)：采用2-NBDG檢測細胞葡萄糖攝取的方法，證實胰島素能

4、促進H9c2心肌細胞葡萄糖的攝取。
　　結(jié)論：2-NBDG能迅速被表達GLUT-1、GLUT-4的H9c2心肌細胞攝取，且被D-Glu競爭性抑制，表明2-NBDG可作為一個方便且敏感的探針，用于檢測細胞葡萄糖攝取的能力。
　　第二部分：Exendin-4對H9c2心肌細胞葡萄糖攝取的影響
　　目的：探索艾塞那肽(Exendin-4，EX-4)對H9c2心肌細胞葡萄糖攝取的影響及其與p38MAPK信號通路的關(guān)系。

5、　　方法：用不同濃度EX-4和不同孵育時間處理H9c2心肌細胞，探討其時效-量效關(guān)系，確定EX-4處理H9c2細胞的最適濃度和時間，以EX-4最適濃度孵育H9c2心肌細胞。本實驗細胞分組：正常對照組(NC組)，EX-4處理組(EX-4組)，EX-4+p38α/β/γ/δMAPK通路抑制劑BIRB796處理組(BIRB796組)，胰島素處理對照組(Insulin組)，熒光標(biāo)記2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)檢測H9c2心肌細胞葡萄糖攝取能力

6、，通過熒光酶標(biāo)儀及流式細胞儀檢測細胞內(nèi)熒光表達強度差異，測出心肌細胞葡萄糖攝取變化。間接免疫熒光法檢測H9c2心肌細胞GLP-1受體(GLP-1R)的表達。
　　結(jié)果：
　　(1)：H9c2心肌細胞膜上表達GLP-1受體；
　　(2)：EX-4處理H9c2心肌細胞的最適濃度和時間分別為200μmol/L和45min。
　　(3)：熒光酶標(biāo)儀結(jié)果示：對照組熒光強度為369.78±59.69，EX-4組熒光強度為48

7、7.96±66.44，Insulin組熒光強度為458.09±26.41，EX-4組和Insulin組與對照組相比均促進H9c2心肌細胞葡萄糖攝取，分別增加24.2％和19，3％(p<0.05)。
　　(4)：流式細胞儀結(jié)果顯示：2-NBDG對照組細胞內(nèi)熒光強度為71.13±12.83，EX-4組細胞內(nèi)熒光強度為119.77±15.32，BIRB79組細胞內(nèi)熒光強度為90.75±4.08，EX-4組較對照組細胞內(nèi)熒光強度增加40.